孫思睿,萬 峰,賀 菁,張 晟,孟祥晨

(東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

乳酸菌在代謝過程中會產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì),如細菌素、有機酸、過氧化氫等,其中細菌素以其優(yōu)良的性能被廣泛用于食品、醫(yī)藥等各個行業(yè)。隨著人們生活水平的提高,健康安全已經(jīng)成為食品生產(chǎn)的必然趨勢,細菌素可以有效地代替食品中化學防腐劑控制病原微生物的生長[1],一定程度上降低了化學添加劑對人體的不良影響,逐漸成為研究的熱點[2]。雖然目前商品化產(chǎn)品僅限于乳酸鏈球菌素Nisin和片球菌素pediocin等有限幾種,但迄今為止,研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)1700多種細菌素,其中300余種為乳酸菌細菌素[3]。

目前,許多國家對Nisin在食品中的添加量已有明確限制,實驗表明人體安全攝入量應(yīng)低于2.9 mg/人/日[4]。同時研究者也在不斷發(fā)掘更多安全且抑菌活性較強的細菌素,以助于更好的應(yīng)用于生產(chǎn)實踐,因此對細菌素抑菌活性的準確檢測及結(jié)果的規(guī)范性表示顯得尤為重要。目前主要采用的檢測方法為瓊脂擴散法和臨界稀釋法,但對細菌素效價的表示暫無統(tǒng)一標準,因此本文旨在比較幾種常見的細菌素抑菌活性的測定方法,同時試圖給出細菌素抑菌活性結(jié)果準確表示的通用方式。

1 乳酸菌細菌素

細菌素是核糖體在微生物生長代謝過程中產(chǎn)生的一類具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽或前體多肽,當達到一定數(shù)量時可以殺死或抑制某些微生物[5],因此可以有效地抑制食物中食源性微生物及某些腐敗菌的生長,起到生物防腐作用。

乳酸菌細菌素有多種分類方式,通常被分為三類:分別是羊毛硫細菌素、非羊毛硫抗生素和溶菌素[6]。細菌素通常在乳酸菌培養(yǎng)至對數(shù)生長末期或穩(wěn)定期前期[7]時產(chǎn)生,它們都通過非特異地吸附到細胞膜表面,使其形成孔洞后釋放水合氫離子和ATP,使質(zhì)子動力(PFM)喪失[8],當細菌素濃度達到一定閾值時會破壞細胞結(jié)構(gòu),從而產(chǎn)生抑菌作用;但能否與細胞進行特異性結(jié)合,還要取決于細胞壁和細胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)。幾種研究較為深入的乳酸菌細菌素如表1所示。雖然細菌素具有一定的抑菌活性,但并不意味著在任何條件下都能夠發(fā)揮應(yīng)有的效應(yīng),這不僅取決于細菌素自身的特性,還取決于對樣品處理的方式以及產(chǎn)細菌素菌株的培養(yǎng)環(huán)境等。此外,細菌素在應(yīng)用過程中也可能面臨著溶解度較低,易被一些蛋白酶類食物組分降解等風險,以及產(chǎn)量小純度較低需要經(jīng)過復(fù)雜的純化后才能應(yīng)用于實際生產(chǎn)等劣勢[9],因此在一定的條件下準確測定其抑菌活性以及保證其能發(fā)揮應(yīng)有的效力顯得尤為重要。

表1 當前研究較深入的乳酸菌細菌素Table 1 The current study on bacteriocins secreted by Lactic acid bacteria

2 含細菌素無細胞發(fā)酵上清液的制備

微生物培養(yǎng)物經(jīng)處理后制備成無細胞發(fā)酵上清液后才能夠用于測定細菌素抑菌活性,主要包括:離心、中和、添加過氧化氫酶除去H2O2等其他抗菌物質(zhì)的干擾[29]。

培養(yǎng)物在離心處理前應(yīng)考慮該菌所產(chǎn)細菌素是僅存在于上清液中,還是會一定程度地吸附于菌體細胞上,以此為依據(jù)來判斷是否僅進行簡單的離心操作來制備無細胞發(fā)酵上清液。Gong等[30]對細菌素plantarumMG進行pH和溫度耐受性實驗,結(jié)果表明該細菌素在pH2.00～10.00的范圍內(nèi)均保持較好的抑菌活性,且在121 ℃下加熱30 min后,抑菌活性也并未降低。但是由于細菌素自身的性質(zhì)不同,為提高抑菌活性檢測的準確度,應(yīng)探究清楚細菌素本身對pH、溫度以及其它營養(yǎng)組分等環(huán)境因素的耐受能力,以免在后續(xù)處理過程中活性下降影響測定結(jié)果。有研究懷疑將培養(yǎng)物透過0.22 μm濾膜可能會影響細菌素的抑菌活性[31],但是Van[32]成功地將大腸桿菌素E2-P9(0)通過該孔徑濾膜而并未損失抑菌活性,因此在現(xiàn)今的實驗中仍然采用濾膜過濾的方式除菌,暫時忽略其可能產(chǎn)生的影響。

某些菌株所產(chǎn)細菌素的濃度較低不利于后續(xù)檢測,可以采用濃縮方法,或?qū)⑵浼兓笤龠M行測定。樣品通常要低溫保藏,且注意保藏時間和避免反復(fù)凍融,有實驗稱反復(fù)凍融三次后細菌素效價會有所下降[33]。Bifidodacteriumspp. 在-20 ℃或-70 ℃下貯藏1～3個月,其效價便由原來的51200 AU/mL降至30000 AU/mL,而當貯存于-4 ℃時,抑菌活性則降至原來的75%[34]。

3 細菌素抑菌活性測定方法

3.1 瓊脂擴散法(AWDA,Agar well diffusion assay)

起初采用臨界稀釋法測定細菌素的抑菌活性,但鑒于瓊脂擴散法在檢測抗生素活性上有很好的應(yīng)用,所以在Tramer等[35]提出將該方法應(yīng)用于細菌素抑菌活性的檢測。根據(jù)媒介不同,又可將其分為牛津杯法、雙層平板打孔法和濾紙片法等。

很多因素會影響抑菌活性測定結(jié)果,如指示菌的數(shù)量、培養(yǎng)時間、擴散時間和溫度以及上樣量等,因此該方法也在不斷地被完善。培養(yǎng)基中瓊脂含量會影響細菌素的擴散速度,通常含量越高擴散速度越慢,但為保證其凝固效果,也不能一味的降低培養(yǎng)基中瓊脂的量。Wolf和Gibbons[36]發(fā)現(xiàn)當瓊脂質(zhì)量濃度為7.5 g/L有助于細菌素的擴散;同時添加一定量的緩沖溶液可以有效緩解低pH對抑菌效果造成的影響。國標GB1886.231-2016[37]在檢測Nisin活性時,向培養(yǎng)基中加入一種表面活性劑吐溫20,促進細菌素的擴散,擴散的越完全會使得其測定的抑菌活性更準確。檢測Nisin抑菌活性時發(fā)現(xiàn),將上樣后的平板置于4 ℃下擴散,既不會使指示菌生長,又能提高檢測準確度,Lalpuria等[38]基于上述研究后發(fā)現(xiàn),孔徑為7 mm抑菌圈直徑大于孔徑為3 mm時,但孔徑較小時精度更高;同時對最佳擴散時長進行建模發(fā)現(xiàn),總體而言,擴散48 h后測定結(jié)果準確度最高。由于不同細菌素其自身特性的不同,導致其分離及測定參數(shù)不能一概而論,應(yīng)根據(jù)每一個步驟中面臨的實際問題,來確定最終的測定方法。

3.2 臨界稀釋法(CDA,Critical dilution assay)

臨界稀釋法可以分為試管稀釋法(TDA,Tube dilution assay)、96孔板法以及濁度法(TA,Turbidometric assay)等,其本質(zhì)均為半定量測定[39]。臨界稀釋法是將待測樣品梯度稀釋,再以一定量加入到含指示菌的培養(yǎng)基中,通過測定吸光值或指示菌活菌數(shù)的變化,最終確定對指示菌生長的抑制率。但需要注意的是,含細菌素的粗提液中含有一定的營養(yǎng)成分,可能會為指示菌的生長提供額外的營養(yǎng),為了排除此影響,可以將樣品透析,剔除小分子營養(yǎng)物質(zhì),盡可能保證實驗的準確性。臨界稀釋法與瓊脂擴散法的區(qū)別見表2所示。

表2 細菌素抑菌活性測定方法比較Table 2 A comparison of methods for the measurement of bacteriocin activity

3.3 其他檢測方法

3.3.1 ELISA測定細菌素抑菌活性 ELISA檢測是將已知量的Nisin溶液涂層于孔板中,添加過量未標記的抗體共同孵育一定時間后,洗去未結(jié)合抗體,加入酶標記抗體,最后添加底物顯示熒光信號。Chollet等[40]測定食品基質(zhì)中脂肪對細菌素擴散效率的影響時將Nisin與抗血清進行競爭性免疫測定,用已知濃度的乳鏈菌肽制備內(nèi)容物,通過反擴散將Nisin從不同脂肪含量的瓊脂糖凝膠中提取并測量。采用ELISA方法檢測出Nisin擴散時間與擴散深度的回歸方程并建立模型,較為準確的檢測凝膠中Nisin的免疫活性。ELISA相對于觀察抑菌圈的大小來說更加的準確和敏感,它通常應(yīng)用于建立細菌素的擴散效率模型,從而對細菌素進行定量檢測。

3.3.2 ATP生物熒光法測定細菌素抑菌活性 細胞內(nèi)含有大量的ATP,可與熒光素發(fā)生反應(yīng),Nina等[41]開發(fā)了一種基于生物發(fā)光傳感器檢測食品中超低量乳酸菌肽的方法,他們將細菌螢光素酶操縱子luxABCDE置于質(zhì)粒pNZ8048中的nisA啟動子的控制下,并轉(zhuǎn)化到兩株乳酸乳球菌中。這些菌株的nisRK基因使其感受乳鏈菌肽并傳遞信號,起始nisA啟動子轉(zhuǎn)錄。由于構(gòu)建的乳酸鏈球菌素生物傳感器菌株NZ9000lux和NZ9800lux經(jīng)乳酸鏈球菌素誘導后發(fā)光,且信號量隨乳酸鏈球菌素含量的增加而增加,因此可以通過發(fā)光強度來檢測Nisin的含量。在細菌素的檢測上,該技術(shù)不需要添加額外的外源底物,利用傳感器直接通過實時成像系統(tǒng)檢測生物發(fā)光情況,操作簡單且費時較短,對于不透明或是指示劑難于選擇的樣品有很好的應(yīng)用;但易受到游離ATP的干擾,以及反應(yīng)體系的最佳條件難以摸索[42]。

除此之外,抑菌活性的測定還可以采用毛細管電泳、電導測定以及輻射法等。相比于常規(guī)實驗室方法而言,這些方法由于相對成本較高且具有一定特異性,目前暫未在實驗中得到廣泛應(yīng)用。但是儀器操作使得結(jié)果更加準確高效,且重復(fù)性更高。這些研究的推進也表明:迫切需要建立一種高效便捷的細菌素抑菌活性的測定方法。

4 細菌素效價的表示方法

通常以三種形式表示細菌素的效價:即國際單位IU/mL、任意單位AU/mL以及細菌素效價自定義單位BU/mL。

4.1 以Nisin為基準定義細菌素效價

由于Nisin效價已被定義為106IU/g,因此可以以抑菌圈直徑或生長抑制率為縱坐標,以Nisin的不同稀釋濃度對應(yīng)的效價值作為橫坐標繪制標準曲線。Delgado等[43]測定四株乳酸菌所產(chǎn)細菌素的抑菌活性,以Nisin為對照,將測定結(jié)果直接帶入標準曲線來計算待測細菌素的效價。此外,賴文等[44]在測定戊糖乳桿菌B8產(chǎn)細菌素動力模型時,也采用該方式以Nisin作為基準確定待測細菌素效價。據(jù)此劉國榮等[45]將純化后的細菌素BB04的效價定義為640 IU/mL。

由于Nisin只有在一定濃度范圍內(nèi)才呈線性關(guān)系,而濃度的確定與指示菌的選擇密不可分。Papagianni等人[46]以不同的菌株作為指示菌,發(fā)現(xiàn)無論采用何種抑菌活性測定方法,在較低的Nisin濃度下,只有對L.curvatusATCC51436和P.acidilacticiATCC25740的抑制率才與濃度呈線性關(guān)系,而對L. sakei的抑制率在Nisin活性為40～1000 IU/mL范圍時才呈良好線性關(guān)系(見圖1)。

4.2 臨界稀釋法以AU/mL為單位定義細菌素效價

在目前的研究性試驗中,細菌素效價最常用的表達方法為AU/mL,且采用該定義方法時通常采用瓊脂擴散法。1 AU/mL被定義為能夠產(chǎn)生明顯抑菌圈的最高稀釋度的倒數(shù)[47-48]。目前得到最廣泛的認可。效價的計算過程簡述如下。先簡單的進行系列梯度稀釋,以稀釋過程中能出現(xiàn)明顯抑菌圈的稀釋度記為稀釋因子D,而每孔中的濃度:

通過計算:

根據(jù)各個不同稀釋度所對應(yīng)抑菌圈的大小繪制標準曲線R=a+blog(d)(式中：R代表抑菌圈直徑mm或抑菌圈面積mm2),可以分別得出斜率b與截距a的值。則細菌素效價[49]:

本實驗室依據(jù)此方法測定植物乳桿菌1.0391在37 ℃培養(yǎng)20 h時所產(chǎn)的細菌素效價,得到標準曲線R=9.1885x+4.4431(R2=0.9956)。

4.3 以BU/mL為單位定義細菌素效價

用濁度法測定細菌素活性時常采用BU/mL表示細菌素效價。指示菌的生長抑制率定義為I:

式中:A1為一定量細菌素與指示菌混合液的吸光值,A0為對照組,即等量無菌水與指示菌混合液的吸光值。

通過測定連續(xù)的稀釋濃度,找尋ID50即一半抑制濃度即(I=0.5),并將此濃度定義為1 BU/mL[50],通過稀釋度的倒數(shù)繪制反曲線方程,計算待測細菌素的效價。三種細菌素效價表示方法的優(yōu)缺點如表3所示。

表3 細菌素效價表示方法的比較Table 3 A comparison of the representation of bacteriocin titer

5 結(jié)論與展望

雖然瓊脂擴散法操作復(fù)雜且受到很多因素影響,但仍然是抑菌活性測定的主流方法。然而隨著研究的逐步推進,廉價實用的試劑盒以及更精準的實驗儀器必將替代手動方式作為高效的檢測手段。目前人們已經(jīng)基于Nisin,對影響抑菌活性測定的pH、擴散溫度及時間、處理方式等一系列相關(guān)因素進行了較為詳盡的研究,期望最大限度地優(yōu)化測定方法,以減小實驗誤差,也獲得了一定成效。此外,目前主要采用AU/mL和IU/mL兩種表示方法定義細菌素效價,而任意單位AU在國際范圍內(nèi)的應(yīng)用更為廣泛,也得到大多數(shù)學者的認可;但由于其是以自身抑菌能力為標準,雖然在實驗中可以通過比較而得出對比結(jié)果,但是若比較兩種或多種不同的細菌素的抑菌活性時,同樣存在諸多不便。因此,在未來的研究中首先應(yīng)盡量創(chuàng)造合適的生產(chǎn)環(huán)境來保證乳酸菌細菌素的活性;其次,仍需要找尋一種改良或替代瓊脂擴散法的方法,以便提高細菌素抑菌活性測定的準確性,更好的挖掘抑菌活性較強的生物防腐劑;此外還應(yīng)探索建立應(yīng)用更加廣泛且具有高認可度的細菌素效價表示方法。相信隨著科技的發(fā)展以及研究的進一步完善,更多的乳酸菌細菌素將被合法使用,乳酸菌細菌素將會廣泛地應(yīng)用到食品防腐、疾病治療等更多領(lǐng)域。