景鳳霞，李云琪，唐靈杰，李小錦，王宇輝，張秀敏

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

自然生境中的微生物物種非常豐富，但可培養(yǎng)物種僅占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%～10%［1］。大多數(shù)對人類有益的微生物仍處于一種不可培養(yǎng)的狀態(tài)，難以得到其純培養(yǎng)物。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法是向樣品提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，然后選擇快速生長的菌落，這些培養(yǎng)方法僅能獲得自然生境中的一小部分細(xì)菌［2］，這就使得絕大多數(shù)細(xì)菌難以被研究和利用。許多研究者通過改變培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件或創(chuàng)新培養(yǎng)方法來解決這一問題。岳秀娟等［3］在培養(yǎng)基中添加丙酮酸鈉、過氧化氫酶和甜菜堿等物質(zhì)用以培養(yǎng)微生物，這些物質(zhì)可以減少微生物代謝過程中產(chǎn)生的活性氧，結(jié)果顯示添加活性氧清除能力物質(zhì)的平板上菌落數(shù)比對照組明顯增加，并且分離得到多株具有抗菌活性的微生物，這種方法為抗生素的篩選和菌種的保藏提供了新的來源。高絲氨酸內(nèi)酯作為一種信號分子也被普遍研究［4］。

Shayne等［5］設(shè)計(jì)了以VL55培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入不同的生長因子，共分離得到包括9門17綱60科的350株細(xì)菌，序列比對結(jié)果顯示，有93株（27%）細(xì)菌為新屬。Tanaka等［6］在滅菌前將磷酸鹽和瓊脂分開，菌落生長的數(shù)量增多，其中超過30%屬于未培養(yǎng)微生物。目前，越來越多的科研工作者致力于利用宏基因組分析方法來尋找新的未培養(yǎng)微生物，研究其遺傳多樣性和微生物群落的結(jié)構(gòu)，以及了解其在生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用［7-8］，并通過使用16S rRNA基因序列對未培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行多樣性分類［9］。也有一些學(xué)者通過采用富集培養(yǎng)的方法，獲得之前未培養(yǎng)的微生物［10］。

本試驗(yàn)以改良的VL55為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向其中添加6種不同的營養(yǎng)因子，通過大量稀釋對采自河北、青海和云南的3份土壤樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，比較可培養(yǎng)細(xì)菌的物種多樣性情況，以期發(fā)現(xiàn)更多新的微生物類群，為開發(fā)新材料、新藥物提供豐富的微生物物種資源。

圖1 土樣1分離菌株的多樣性分布

圖2 土樣2分離菌株的多樣性分布

圖3 土樣3分離菌株的多樣性分布

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土樣采集：試驗(yàn)于2016年在河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，供試土壤樣品分別采自河北淶水縣上港村、青海三江源、云南無量山3個(gè)地區(qū)，分別記為土樣1、土樣2和土樣3，分別風(fēng)干、研碎、除去石子和細(xì)根，過2 mm篩備用。

培養(yǎng)基：改良的VL55基礎(chǔ)培養(yǎng)基：2-（N-嗎啉）乙磺酸3.9 g，七水合硫酸鎂0.048 g，氯化鈣0.067 g，磷酸氫二銨0.053 g，丙酮酸鈉0.8 g，結(jié)冷膠3%，蒸餾水1 L。滅菌前加入2 mL亞硒酸-鎢酸鹽溶液［11］和2 mL 微量元素溶液SL-10［12］。 用 0.2 mol/L 的 NaOH 和 0.1 mol/L 的KOH混合液調(diào)節(jié)改良的VL55基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH與土壤pH一致，高溫滅菌后，在使用前加入維生素溶液1和維生素溶液2［13］。然后分別添加6種不同的營養(yǎng)因子（表1）。

PCR擴(kuò)增試劑：使用細(xì)菌通用16S rRNA基因引物27f （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）［15］和1492r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）［16］，引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：TaqDNA聚合酶、10×Taq PCR Buffer（含Mg2+）、10 mmol /L 高純dNTPs（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

表1 6種不同營養(yǎng)因子組合

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離與保存 土樣1、土樣2和土樣3各稱取1 g樣品，分別加入99 mL VL55液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻，取0.5 mL土壤懸浮液于4.5 mL試管中進(jìn)行10-1～10-7梯度稀釋，之后涂布分離進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果確定100 μL菌液中盡可能低于1個(gè)細(xì)胞的稀釋度。經(jīng)統(tǒng)計(jì)得出土樣1的10-4梯度每100 μL菌液中含細(xì)胞總數(shù)為5個(gè)，土樣2的10-4梯度每100 μL菌液中含細(xì)胞總數(shù)為5個(gè)，土樣3的10-5梯度每100 μL菌液中含細(xì)胞總數(shù)為3個(gè)。因此，3種土壤樣品均選擇10-4、10-5、10-6、10-74個(gè)梯度進(jìn)行大量稀釋，每個(gè)梯度取100 μL至裝有5 mL添加不同營養(yǎng)因子組合的VL55液體培養(yǎng)基的試管中，直至將每個(gè)梯度試管內(nèi)的液體分裝完畢，每個(gè)梯度分裝45支試管，每種土樣稀釋液共分裝試管1 080支。然后置于28℃、200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)。

待試管內(nèi)的培養(yǎng)液渾濁后，接種至R2A固體平板上，置于28℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)；待平板上長出菌落后，挑取單菌落于R2A液體培養(yǎng)基中，置于28℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)；待菌體長出后，用顯微鏡驗(yàn)純，吸取0.5 mL菌液于含有50%甘油的甘油管中，每株菌保藏兩支甘油管，-20℃保藏菌體。剩余菌體經(jīng)12 000 r/min離心、收集，用于提取基因組DNA。

1.2.2 細(xì)菌DNA的提取和16S rRNA基因擴(kuò)增 使用康為世紀(jì)生物科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。使用細(xì)菌通用引物27f和1492r對菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系為50 μL，其中包括0.5μL上游和下游引物（20 μmol/L），2 μL DNA（70 ng/μL）模板，1 μL dNTP （10 mmol/L），5 μL 10×Buffer，0.3 μLTaqDNA 聚合酶（5 U/μL），加入無菌去離子水至要求的體積。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min、55℃退火45 s、72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.3 16S rRNA基因測序及系統(tǒng)進(jìn)化分析 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收，送通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司測序。利用EzBiocloud對菌株測序所得的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對，找出親緣關(guān)系最近的模式菌株的16S rRNA基因序列及相似值。再利用BioEidt和MEGA 5.0軟件對分離得到的新物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用Neighbour-Joining模型，進(jìn)而確定其系統(tǒng)發(fā)育地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌菌株分離結(jié)果

2.1.1 土樣1 將土樣1進(jìn)行梯度稀釋，再經(jīng)大量稀釋分裝于添加不同營養(yǎng)因子的VL55液體培養(yǎng)基中，將分離所得菌株的16S rRNA基因序列在EzBioCloud中進(jìn)行同源性比對，得出土樣1的分離結(jié)果，對照分離得到5個(gè)屬，添加6種營養(yǎng)因子的處理共分離得到22個(gè)屬。從圖1（封三）可以看出，土樣1添加6種不同營養(yǎng)因子處理均分離到對照未分離到的微球菌屬（Micrococcus）的菌株，其中，添加營養(yǎng)因子組合1分離得到特有的農(nóng)球菌屬（Agrococcus）、考克氏菌屬（Kocuria）和塚村氏菌屬（Tsukamurella）的菌株，添加營養(yǎng)因子組合2分離得到特有的短桿菌屬（Brevibacterium）、纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）和原小單孢菌屬（Promicromonospora）的菌株，添加營養(yǎng)因子組合6分離得到特有的博斯氏菌屬（Bosea）、極單胞菌屬（Polaromonas）和鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）的菌株。

2.1.2 土樣2 將土樣2按照土樣1的處理方式進(jìn)行處理，其分離結(jié)果（圖2，封三）顯示，對照分離得到2個(gè)屬，添加6種營養(yǎng)因子的處理共分離得到17個(gè)屬，其中，處理1分離得到特有的鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）的菌株，處理2分離得到特有的慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、東屬（Dongia）和貪噬菌屬（Variovorax）的菌株，處理3分離得到特有的阿菲波菌屬（Af i pia）的菌株，處理5分離得到特有的放線多形菌屬（Actinopolymorpha）、卡西列羅屬（Caballeronia）和莫拉氏菌屬（Moraxella）的菌株，處理6分離得到特有的類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的菌株。

2.1.3 土樣3 將土樣3按照土樣1處理方式進(jìn)行處理，其分離結(jié)果（圖3，封三）顯示，對照分離得到6個(gè)屬，添加6種營養(yǎng)因子的處理共分離得到15個(gè)屬，其中，處理1分離得到特有的無色小桿菌屬（Achromobacter）和根瘤菌屬（Rhizobium）的菌株，處理2分離得到特有的貪銅菌屬（Cupriavidus）和貪噬菌屬（Variovorax）的菌株，處理5分離得到特有的假芽孢桿菌屬（Fictibacillus）的菌株，處理6分離得到特有的節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和纖維單胞菌屬（Cellulomonas）的菌株。

2.2 潛在新種16S rRNA基因相似性比對結(jié)果

目前認(rèn)為劃分細(xì)菌新種的16S rRNA基因序列相似性閾值是98.65%［17］。通過在改良的VL55培養(yǎng)基中添加6種不同的營養(yǎng)因子，利用大量稀釋法對采自河北、青海和云南的3份土壤樣品進(jìn)行微生物物種的分離。結(jié)果（表2）顯示，有12個(gè)菌株與其參比菌株的16S rRNA基因序列相似性均低于98.6%。其中，土樣1未分離得到序列相似性低于98.65%的菌株，不存在替在新種，土樣2、土樣3分別分離得到4株和8株潛在新種。因此，這12個(gè)菌株很有可能為潛在的新種，按隸屬7個(gè)不同的屬分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4～圖9。

表2 不同土樣添加營養(yǎng)因子處理分離得到潛在新種的比對結(jié)果

圖4 依據(jù)16S rRNA 基因序列構(gòu)建的HBUM200206相關(guān)菌株的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 依據(jù)16S rRNA 基因序列構(gòu)建的HBUM200202相關(guān)菌株的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 依據(jù)16S rRNA 基因序列構(gòu)建的葉桿菌屬相關(guān)菌株的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 依據(jù)16S rRNA 基因序列構(gòu)建的HBUM200352相關(guān)菌株的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

圖8 依據(jù)16S rRNA 基因序列構(gòu)建的副伯克霍爾德氏菌屬相關(guān)菌株的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

圖9 依據(jù)16S rRNA 基因序列構(gòu)建的HBUM200497相關(guān)菌株的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

本研究通過在培養(yǎng)基中添加不同營養(yǎng)因子，對采自河北、青海和云南的3份土壤樣品的微生物進(jìn)行大量稀釋分離，結(jié)果表明分離得到的微生物物種多樣性均較對照豐富；添加不同營養(yǎng)因子的培養(yǎng)基處理分離得到各自獨(dú)特的微生物類群，表明不同的營養(yǎng)因子能夠選擇性分離得到不同微生物類群，對于豐富微生物物種多樣性有重要意義。

綜合來看，3份土壤樣品在添加營養(yǎng)因子1和2的培養(yǎng)基中分離得到的菌株種類均較對照豐富，添加營養(yǎng)因子4的培養(yǎng)基分離得到的菌株種類均較對照少。其中，營養(yǎng)因子1中的N-乙酰葡萄糖胺能夠與N-乙酰胞壁酸經(jīng)β-1，4糖苷鍵連接間隔排列形成細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖，添加N-乙酰葡萄糖胺有利于保持細(xì)胞外形并保護(hù)細(xì)菌抵抗低滲環(huán)境，起到一定的屏障作用，更有利于細(xì)菌存活。

營養(yǎng)因子2中葡萄糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖等作為菌株的碳源可以促進(jìn)其生長繁殖。當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)含有葡萄糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖及其他碳源時(shí)，細(xì)菌會(huì)優(yōu)先使用葡萄糖作為碳源，而當(dāng)其耗盡時(shí)，細(xì)菌需要經(jīng)過一定時(shí)間的適應(yīng)，才能利用乳糖及其他碳源繼續(xù)生長。補(bǔ)充不同的碳源會(huì)引起菌體生理及生長特性變化，使其分離得到的菌株更為豐富。

營養(yǎng)因子4中乙酸鈉、苯甲酸鈉、L-乳酸鈉均為常見的防腐劑，能夠抑制微生物的生長繁殖。乙酸鈉作為一種廣譜型防腐劑，能夠抑制細(xì)菌、霉菌及酵母菌的生長；苯甲酸鈉具有較強(qiáng)的抑菌作用，可通過擴(kuò)散的方式被細(xì)菌所攝取，改變細(xì)胞膜的通透性，抑制細(xì)胞膜對氨基酸的吸收；L-乳酸鈉對致病菌有很好的抑制作用，因此添加營養(yǎng)因子4使菌株的豐富性下降。

此前，16S rRNA基因序列和DNA-DNA雜交比較的結(jié)果顯示，70%的DNA-DNA匹配性對應(yīng)于約97%的16S rRNA基因相似性，即界定種的閾值為97%。Kim等［17］研究報(bào)道，區(qū)分兩個(gè)不同種的16S rRNA基因序列相似性的臨界值為98.65%，即兩株菌的16S rRNA基因序列相似性在98.65%以下，則認(rèn)為它們屬于不同種，不需要做DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)。

本研究結(jié)果表明，分離得到的菌株HBUM200206與 運(yùn) 動(dòng) 東 菌（Dongia mobilis）LM22T的親緣關(guān)系最近，序列相似性為94.58%，可能是紅螺菌科（Rhodospirillaceae）的一個(gè)潛在新屬。菌株HBUM200202、HBUM200206、HBUM200239、HBUM200240、HBUM200352、HBUM200424、HBUM200427、HBUM200448、HBUM200452、HBUM200488、HBUM200497和HBUM200503與親緣關(guān)系最近的模式菌株的16S rRNA基因序列相似性均小于98.65%，可能為潛在的新種。