楊移斌，艾曉輝*，宋懌，姚嘉赟，曹海鵬，楊先樂(lè)，沈錦玉*

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100141； 3. 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省魚(yú)類(lèi)健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州 313001；4. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

黃芪是常見(jiàn)的補(bǔ)氣中藥[1-2]。黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides，APS)是從黃芪根部提取的多糖成份，主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等組成，具有免疫調(diào)節(jié)作用[3]，能夠廣泛提高機(jī)體免疫功能及抗病能力，而其同時(shí)又具備自然資源豐富、價(jià)格低廉、毒性弱及無(wú)殘留等特點(diǎn)[4]，因此常作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于醫(yī)療、畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中。研究證實(shí)，適量添加黃芪多糖可以有效提高魚(yú)類(lèi)增重率、溶菌酶活性和SOD 酶活性，能夠增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)非特異性免疫[5]。

中華鱉(Trionyxsinensis)又名甲魚(yú)[6]，是國(guó)內(nèi)特有的養(yǎng)殖鱉種類(lèi)，具備較高營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值，市場(chǎng)需求較大。隨著市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)增，中華鱉養(yǎng)殖模式不斷創(chuàng)新，逐漸朝著集約化程度更高的養(yǎng)殖方向前進(jìn)。與此同時(shí)，中華鱉遭受病原侵襲的機(jī)會(huì)急劇增多，使得中華鱉經(jīng)常處在應(yīng)激狀態(tài)甚至暴發(fā)嚴(yán)重病害[7]，從而降低了其生長(zhǎng)速度、成活率及養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，制約了中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。而中華鱉病害防治的主要手段仍然是依靠化學(xué)藥物，存在藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在飼料中添加不同量的黃芪多糖，探討定期投喂黃芪多糖對(duì)中華鱉生長(zhǎng)、血液生化指標(biāo)及抗病力影響，以期為黃芪多糖在中華鱉養(yǎng)殖業(yè)中的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用中華鱉的規(guī)格為(35.46±0.54)g，共600只，活力強(qiáng)，體表無(wú)明顯傷病，由湖北京山鱉原種場(chǎng)提供；嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)由本實(shí)驗(yàn)室自行分離、鑒定及保存；黃芪多糖粉購(gòu)自北京生泰爾生物科技有限公司，每1 g商品中黃芪多糖含量≥450 mg；基礎(chǔ)飼料采用佛山市順德區(qū)永勝飼料實(shí)業(yè)有限公司提供的幼鱉飼料，其主要成分見(jiàn)表1。

表1 飼料的主要成分及含量(干重計(jì))Tab.1 Main ingredients and contents of feed(eq.-dry diet)

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將黃芪多糖添加到中華鱉幼鱉基礎(chǔ)飼料中，制成黃芪多糖含量分別為0.00、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%的實(shí)驗(yàn)飼料，經(jīng)過(guò)充分混勻后，55 ℃干燥粉料，并密封保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將挑選好的600只中華鱉隨機(jī)分成5組，其中對(duì)照組飼喂不含黃芪多糖的基礎(chǔ)日糧，其余實(shí)驗(yàn)組分別投喂含0.25%、0.50%、0.75%和1.00%黃芪多糖的實(shí)驗(yàn)飼料，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40只中華鱉。

1.2.2 養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地由鱉原種場(chǎng)提供，幼鱉置于直徑為2 m的圓形玻璃缸中飼養(yǎng)，入缸前經(jīng)7 d暫養(yǎng)及0.000 1%高錳酸鉀溶液浸泡處理，入缸后經(jīng)15 d基礎(chǔ)飼料馴化。玻璃缸中水質(zhì)指標(biāo)保持在水溫25～30 ℃，溶氧≥5.5 mg/L，pH 6.8～7.5，氨氮≤0.1 mg/L，亞硝酸≤0.01 mg/L。按照體重2%～3%進(jìn)行飽食投喂，每天投喂3次， 2 h后清除殘餌，觀察幼鱉活動(dòng)情況，記錄發(fā)病死亡數(shù)，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)持續(xù)40 d。

1.2.3 取樣

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)中華鱉饑餓24 h后，稱重記錄終末體重，然后每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取3只中華鱉進(jìn)行丁香酚麻醉后頸部采血。將采好的血，置于4 ℃冰箱5 h，再進(jìn)行離心收集血清，保存于-20 ℃?zhèn)溆肹9]。

1.2.4 樣品測(cè)定

1.2.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)用中華鱉初始體重與終末體重，測(cè)定其增重率(weight gain rate，WGR)及特定生長(zhǎng)率(specific growth rate，SGR)，根據(jù)中華鱉各組的初、末尾數(shù)計(jì)算其成活率，其公式表示為：

增重率(WGR，%)=(Wt-W0)/W0×100；

特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=(lnWt-lnW0)/n×100；

成活率(Survival rate，SR，%)=終尾數(shù)/初尾數(shù) ×100；

式中，Wt代表魚(yú)終末均體重(g)，W0代表魚(yú)初始均體重(g)，n為飼養(yǎng)天數(shù)(d)。

1.2.4.2 免疫相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活力，定義: 100 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位；酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)活力，定義: 100 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位；溶菌酶(lysozyme，LZM)活力，LSZ 在血清中單位為U/mL；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力，定義: 每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD活力單位(U)；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)，定義：每0.1 mL血清在37 ℃反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個(gè)活力單位。各指標(biāo)測(cè)定均參照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 攻毒實(shí)驗(yàn)

攻毒實(shí)驗(yàn)使用由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存的嗜水氣單胞菌，參照劉宗英等[10]方法并稍作修改后進(jìn)行。將活化后的嗜水氣單胞菌，經(jīng)普通營(yíng)養(yǎng)肉湯28 ℃振蕩培養(yǎng)18 h后，經(jīng)無(wú)菌生理鹽水稀釋調(diào)整濃度為2.0×107CFU/mL。待養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，自實(shí)驗(yàn)組的每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取30只中華鱉注射嗜水氣單胞菌，劑量為每只0.1 mL，對(duì)照組注射0.1 mL 0.85%生理鹽水。繼續(xù)投喂基礎(chǔ)飼料，養(yǎng)殖14 d，及時(shí)觀察中華鱉活動(dòng)情況，并記錄發(fā)病死亡數(shù)量。并參照以下公式計(jì)算存活率：存活率(%)=(1-發(fā)病及死亡總數(shù)/總數(shù))×100。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行組內(nèi)均值、組間單因素方差 (ANOVA) 以及Duncan多重比較分析，當(dāng)P<0.05 時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同黃芪多糖添加量對(duì)中華鱉生長(zhǎng)的影響

如表2所示，中華鱉生長(zhǎng)情況因黃芪多糖添加量的不同存在較大差異。黃芪多糖添加組的生長(zhǎng)情況均與對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)，表明在基礎(chǔ)飼料中添加黃芪多糖可以顯著促進(jìn)中華鱉生長(zhǎng)。其中添加量為0.75%的實(shí)驗(yàn)組促進(jìn)生長(zhǎng)趨勢(shì)更明顯，其增重率與1%添加組差異不顯著(P>0.05)，與其他組存在顯著差異(P<0.05)，特定生長(zhǎng)率除與0.50%組差異不顯著外(P>0.05)，與其他組均存在顯著差異(P<0.05)。黃芪多糖添加組的中華鱉成活率均與對(duì)照組0.00%)存在顯著差異(P<0.05)，其中0.25%與0.5%組、0.75%與1.00%組之間不存在顯著差異(P>0.05)。這表明黃芪多糖可以明顯提高中華鱉養(yǎng)殖成活率，但是添加量在0.25%～1.00%對(duì)中華鱉生長(zhǎng)的影響差別不大。

表2 不同黃芪多糖添加量對(duì)中華鱉生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effects of different Astragalus polysaccharides levels on growth performance of Trionyx sinensis

2.2 不同黃芪多糖添加量對(duì)中華鱉免疫相關(guān)指標(biāo)影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，添加黃芪多糖可以顯著提高中華鱉AKP活力，與未添加黃芪多糖的對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)，其中以0.75%活力最強(qiáng)；0.25%、0.50%及0.75%實(shí)驗(yàn)組中華鱉ACP與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，而1.00%組與對(duì)照組差異不顯著(P<0.05)，表明添加黃芪多糖可以提高中華鱉血清中ACP活力，但當(dāng)添加量超過(guò)1.00%時(shí)，ACP活力降低。實(shí)驗(yàn)組中華鱉血清中LZM、SOD活力均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而且均以添加量為0.75%時(shí)達(dá)到最強(qiáng)。添加不同量黃芪多糖可以明顯提高中華鱉血清中GSH-PX活力(P<0.05)，其中以添加量0.75%實(shí)驗(yàn)組活力最強(qiáng)，與對(duì)照組相比高49.12%，結(jié)果表明在基礎(chǔ)飼料中添加不同量黃芪多糖可以提高中華鱉GSH-PX活性?？傮w來(lái)看，添加組與對(duì)照組存在差異，而且隨著添加量的增加，5種酶均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，5種酶活力均在0.75%實(shí)驗(yàn)組中達(dá)到最大值。上述結(jié)果說(shuō)明，黃芪多糖可以在一定程度上影響中華鱉免疫酶活力；從免疫酶活力角度考慮，0.75%是最適添加量。

2.3 不同黃芪多糖添加量對(duì)中華鱉抗病力的影響

由表4可知，經(jīng)人工注射嗜水氣單胞菌感染后的中華鱉，其健康率隨黃芪多糖添加量的增加而提高，且實(shí)驗(yàn)組均與對(duì)照組存在顯著性差異(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組中，0.25%添加組的健康率與其余實(shí)驗(yàn)組存在顯著差異(P<0.05)；0.75%添加組的中華鱉的健康率最高，但與0.50%和1.00%添加組之間差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同黃芪多糖添加量對(duì)中華鱉免疫指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of different Astragalus polysaccharides levels on immune indices of Trionyx sinensis

表4 黃芪多糖不同添加量對(duì)中華鱉抗病力的影響Tab.4 Effects of different Astragalus polysaccharides levels on disease resistance of Trionyx sinensis

3 討論

3.1 適量的黃芪多糖促進(jìn)中華鱉的生長(zhǎng)

黃芪多糖作為從黃芪根部提取的具有生物活性功能物質(zhì)，可促進(jìn)細(xì)胞中的RNA、DNA及蛋白質(zhì)的合成，增加cGMP、cAMP等的含量[11]。同時(shí)黃芪多糖亦能促進(jìn)動(dòng)物胃液分泌及食物消化，參與機(jī)體的物質(zhì)代謝過(guò)程，促進(jìn)腸道益生菌繁殖，加強(qiáng)消化酶分泌，從而提高動(dòng)物成活率、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化能力及蛋白質(zhì)合成能力，提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度[12-13]。向梟等[14]研究表明，當(dāng)黃芪多糖添加量從0增加到0.04%時(shí)，齊口裂腹魚(yú)的增重率(WGR)從(40.23±2.09)%增加到(110.31±6.48)%，特定生長(zhǎng)率(SGR)從(0.84±0.04)%/d 增加到(1.86±0.08)%/d，且差異顯著(P<0.05)；飼料中分添加3.0%的黃芪微粉、0.5%的黃芪多糖以及5%的微膠囊劑型黃芪多糖養(yǎng)殖刺參，實(shí)驗(yàn)組的特定生長(zhǎng)率與對(duì)照組相比，分別提高30.03%、20.94%及85.38%[15-16]；當(dāng)黃芪多糖添加量為0.2%時(shí)，可以明顯提高克氏原螯蝦的增重率[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)添加黃芪多糖同樣可以促進(jìn)羅非魚(yú)的生長(zhǎng)速度，其原因可能是黃芪多糖可以促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的腸絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度和肌層厚度以及腸道黏液細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量增加[18]。本研究表明，隨著黃芪多糖添加量增加，生長(zhǎng)速度加快，成活率也增高，但當(dāng)添加量達(dá)到0.75%時(shí)，特定生長(zhǎng)速率及成活率均達(dá)到最高，而后出現(xiàn)下降。其可能原因在于黃芪多糖能促進(jìn)中華鱉食物消化，增加食物消化利用率等，但黃芪多糖不是添加越多越好。

3.2 適量的黃芪多糖提高中華鱉的免疫酶活力

水產(chǎn)動(dòng)物非特異性免疫是其主要的免疫防御方式，主要由抗氧化系統(tǒng)、溶菌酶及補(bǔ)體系統(tǒng)組成[19-20]。堿性磷酸酶AKP 及酸性磷酸酶ACP是機(jī)體中重要的代謝酶，AKP可以催化磷酸單酯水解，但AKP是直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移, 可加速物質(zhì)的攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)[21]，為ADP 磷酸化形成ATP 提供無(wú)機(jī)磷酸[22]；而ACP 是巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體的標(biāo)志酶，也是重要組成部分，經(jīng)研究證實(shí)，在甲殼動(dòng)物血細(xì)胞進(jìn)行吞噬及包圍化的免疫反應(yīng)中，會(huì)伴隨有ACP的釋放[23]。溶菌酶(LZM)在機(jī)體免疫清除過(guò)程中起到重要作用，其主要作用機(jī)理在于溶解入侵病原菌的細(xì)胞壁，同時(shí)還可誘導(dǎo)及調(diào)節(jié)其他免疫因子的合成釋放等[24]；超氧化物歧化酶(SOD)活性與機(jī)體免疫水平關(guān)系密切，是機(jī)體清除活性氧自由基的主要工具[25]，保障細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)免受危害，同時(shí)也可以增強(qiáng)吞噬細(xì)胞活性及免疫蛋白的產(chǎn)生；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)在生物體內(nèi)廣泛存在，主要功能是避免細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能受到損害。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)的活力變化評(píng)價(jià)黃芪多糖對(duì)中華鱉免疫的影響。研究表明，飼料中添加黃芪多糖可明顯提高異育銀鯽非特異性免疫力，其血清中LSZ、SOD 活性顯著提高[26]；黃芪多糖添加水平為0.4%～0.8%時(shí)，可以提高克氏原螯蝦非特異性免疫水平[17]；另黃芪多糖還可以促進(jìn)機(jī)體免疫細(xì)胞增殖、活化及抗體合成[27]，能增強(qiáng)體液免疫及顯著提高機(jī)體非特異性免疫。上述研究說(shuō)明黃芪多糖可以對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫力有較大影響。周顯青等[28]研究發(fā)現(xiàn)黃芪可以提高中華鱉血細(xì)胞的的吞噬能力，促進(jìn)中華鱉血清溶菌活力和殺菌活力，即能促進(jìn)中華鱉的非特異性免疫功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，投喂添加不同含量黃芪多糖的飼料可以提高中華鱉AKP、ACP、LSZ、SOD和GSH-PX的活性，且其活性在一定范圍內(nèi)均隨著黃芪多糖添加量增加而增強(qiáng)，并在添加量為0.75%時(shí)5種酶活力均達(dá)到最高值；當(dāng)黃芪多糖添加量達(dá)到1.00%時(shí)，5種酶活力均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。說(shuō)明黃芪多糖對(duì)中華鱉的免疫增強(qiáng)作用與其添加量之間并不呈簡(jiǎn)單的線性正相關(guān)作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同向梟等[14]、胡兵等[26]及張偉妮等[29]等相同，也進(jìn)一步證實(shí)了添加黃芪多糖可以提高中華鱉的非特異性免疫。

3.3 適量的黃芪多糖提高中華鱉的抗病力

已經(jīng)有研究結(jié)果證明，嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)能夠引起中華鱉暴發(fā)多種病癥，如紅脖子病、紅底斑病、穿孔病和腐皮病等，是導(dǎo)致人工飼養(yǎng)中華鱉患病死亡的主要致病菌[7]，已經(jīng)成為制約中華鱉養(yǎng)殖業(yè)快速健康發(fā)展的“瓶頸”因素之一。因此，本研究選擇嗜水氣單胞菌作為攻毒實(shí)驗(yàn)菌具有較強(qiáng)的針對(duì)性及實(shí)用性。

目前尚未有關(guān)于黃芪多糖對(duì)中華鱉抗病力影響的報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，添加0.25%黃芪多糖即可提高中華鱉的健康率(P<0.05)，較對(duì)照組提高了250.11%，其中又以添加量為0.75%時(shí)健康率最高，效果最好，這也與增強(qiáng)中華鱉免疫效果結(jié)論一致，原因可能在于黃芪多糖通過(guò)提高中華鱉的非特異性免疫，從而增強(qiáng)其抵抗嗜水氣單胞菌感染的能力而保持健康。因此，黃芪多糖可以顯著提高中華鱉抗病力，而其作用的分子機(jī)制及調(diào)控機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能顯著促進(jìn)中華鱉生長(zhǎng)，增強(qiáng)其免疫及抗病力。建議在中華鱉飼料中添加適量黃芪多糖，推薦添加量為0.75%。