趙付文，劉志鴻，榮小軍

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室, 山東 青島 266071)

中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速已成長為水產(chǎn)品生產(chǎn)大國，僅2016年全國水產(chǎn)品產(chǎn)量6 900萬t，比上年增長3.0%。其中，養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量5 156萬t，增長4.4%；捕撈水產(chǎn)品產(chǎn)量1 744萬t，下降1.0%[1]。目前，中國允許使用的水產(chǎn)獸藥中抗生素類藥物有氨基糖苷類、四環(huán)素類、酰胺醇類、磺胺類和部分喹諾酮類藥物。無節(jié)制、不合理規(guī)范的用藥情況時有發(fā)生，使水產(chǎn)品藥物殘留問題日益突出。由此引發(fā)的食品安全危機(jī)受到了越來越廣泛的關(guān)注。

喹諾酮類抗菌藥是指人工合成的一類抗菌藥物，這種類型的抗菌藥物在臨床上的應(yīng)用已經(jīng)有40多年的歷史了。其主要有4代，第1代主要對大腸桿菌起作用；第2代主要對綠膿桿菌、沙雷桿菌等菌群的抗菌效果較好；第3代抗菌譜增加了葡萄球菌等革蘭陽性菌和一些革蘭陰性菌；第4代引入8-甲氧基加強(qiáng)了抗厭氧菌活性，此類藥物的不良反應(yīng)更小，但相對來說價格較貴。作為水產(chǎn)動物和魚類細(xì)菌性疾病的克星，已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病的治療中，而其獸藥殘留問題亦已引起各國的極大關(guān)注[2]。中國以及歐盟、美國及日本等國家和地區(qū)都將喹諾酮類藥物列入限制使用的獸藥藥物名單中, 并制訂出相關(guān)的最高殘留限量。用藥安全已成為水產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的主要矛盾，通過開展喹諾酮類藥物的的毒性研究、殘留限量及水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留的檢測方法，以期能為合理、科學(xué)地使用該類藥物，防止耐藥性產(chǎn)生提供參考。

1 部分喹諾酮類藥物殘留限量

針對喹諾酮類藥物殘留危害，各國政府十分重視并及時對部分種類制定了殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，美國則明令禁止喹諾酮類抗菌藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用。2015年9月1日起，中國農(nóng)業(yè)部公告第2292號，即“決定在食品動物中停止使用洛美沙星等4種獸藥，撤銷相關(guān)獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號”。喹諾酮類按發(fā)明先后及其抗菌性能的不同，分為1～4代。從分子結(jié)構(gòu)上來看，第2代喹諾酮類藥物增加了部分抗菌活性的基團(tuán)；第3代喹諾酮類藥物在C6位引入氟，C7引入堿性哌嗪基，使抗菌活性大大增加；第4代喹諾酮類在結(jié)構(gòu)上引入8-甲氧基，C7位上的氮雙氧環(huán)結(jié)構(gòu)從而加強(qiáng)了抗厭氧菌活性。從藥理作用上來看，前三代的喹諾酮作用于DNA回旋酶(拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ)，干擾細(xì)菌細(xì)胞的DNA復(fù)制而呈現(xiàn)殺菌作用，第4代喹諾酮既作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，也作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，干擾細(xì)菌細(xì)胞的DNA復(fù)制，染色體受損從而產(chǎn)生殺菌作用。主要藥物的名稱、藥理作用和在水產(chǎn)品中的最大殘留限量(MRLs)詳見表1。

表1匯總了16種喹諾酮類藥物在水產(chǎn)品中的MRL和標(biāo)準(zhǔn)來源，其中第3代喹諾酮類藥物在水產(chǎn)品中的應(yīng)用最廣泛，相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)也較全面。各國在水產(chǎn)品中喹諾酮類最大殘留限量不盡相同，中國農(nóng)業(yè)部規(guī)定了第3代氧氟沙星、培氟沙星和洛美沙星在食品動物中禁止添加，美國規(guī)定了第3代氟羅沙星禁止檢出，日本也限定了其中3種第3代喹諾酮類藥物的限量。各國對第2代喹諾酮類藥物的MRL絕大部分均都高于100 μg/kg，對第3代的MRL則低于此值。以第3代二氟沙星為例，中國農(nóng)業(yè)部與歐盟標(biāo)準(zhǔn)對在水產(chǎn)脂肪的MRL規(guī)定相同(100 μg/kg)，表明中國對喹諾酮類藥物在水產(chǎn)品中的MRL標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定上與國際基本接軌。

表1 部分國家或地區(qū)規(guī)定的喹諾酮類水產(chǎn)品中最大殘留限量(MRLs)Tab.1 The maximum residue limits(MRLs)of quinolone aquatic products in some countries or regions

續(xù)表1，Tab.1 Continued

2 喹諾酮類藥物殘留檢測方法

各國政府對喹諾酮類殘留檢測的研究都非常重視，檢測方法主要包括：高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法等檢測法等。

2.1 高效液相色譜法

HPLC具有分離能力強(qiáng)、靈敏度高和應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點，該方法配合各種前處理技術(shù)手段，如基質(zhì)固相分散萃取、固相萃取[3]和超臨界流體萃取[4]等，采用高效色譜柱、高壓泵和高靈敏度的檢測器，柱前或柱后衍生化技術(shù)以及計算機(jī)聯(lián)用等，大大提高了液相色譜的檢測效率、靈敏度和分析速度。

朱品玲等[5]應(yīng)用HPLC法建立了測定水產(chǎn)品肌肉中4種喹諾酮類殘留量的方法，采用乙腈-二氯甲烷(4∶3，V/V)為提取液，濃縮至干，用20%乙腈水溶解殘留物。HPLC條件：熒光檢測器激發(fā)波長280 nm，流動相為0.010 mol/L四丁基溴化銨溶液(pH 3.0)-乙腈(95∶5，V/V)，4種物質(zhì)的工作曲線線性范圍0.05～1.00 μg/mL，水產(chǎn)品肌肉組織中檢測限為3 μg/kg，測定低限為10 μg/kg，該方法適用于檢測水產(chǎn)品體內(nèi)的喹諾酮類殘留。

表2列出了水產(chǎn)品中喹諾酮類殘留高效液相色譜檢測方法的應(yīng)用情況，對喹諾酮同時分離種類、基質(zhì)材料、提取溶劑、流動相、檢出限和定量限進(jìn)行了詳細(xì)匯總。從表中看出線性范圍大多在0.1～10.0 μg/mL，檢測限多為10 μg/kg，HPLC法具有較好的分離度、靈敏度及準(zhǔn)確度的特點，是目前應(yīng)用最多的一種方法。但HPLC法檢測時，由于方法和儀器自身的限制，檢出限難以進(jìn)一步降低，而且HPLC對于多種喹諾酮殘留同時檢測時效果一般，不適用于大量樣品的快速分析和現(xiàn)場檢測。另外，高效液相色譜方法存在溶劑消耗及環(huán)境污染較大、樣品前處理復(fù)雜等弊端，成為制約高效液相色譜發(fā)展的瓶頸。

2.2 高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法

HPLC-MS/MS具有同時分析多組分殘留的檢測，工作原理是樣品中的被分析物經(jīng)液相色譜柱分離后被輸送到質(zhì)譜，并依據(jù)特定的質(zhì)荷比(m/z)離子進(jìn)行選擇，所選擇的母離子產(chǎn)生具有特定結(jié)構(gòu)信息的產(chǎn)物離子，從而對目標(biāo)化合物進(jìn)行選擇性定量分析。它將色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度這兩種優(yōu)勢結(jié)合在一起，可以對很多種類的化合物進(jìn)行詳細(xì)分析，HPLC-MS/MS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品中喹諾酮類物質(zhì)的分析，如表3所示。

HPLC-MS/MS方法分析線性范圍較廣，特異性強(qiáng)，能準(zhǔn)確地對微量獸藥多種殘留組分同時進(jìn)行檢測，且同時檢測的生物數(shù)量明顯多于HPLC方法。HPLC-MS/MS方法可以直接分析極性化合物、熱不穩(wěn)定性化合物、不揮發(fā)性化合物和大分子化合物，不需衍生化步驟。另外，HPLC方法無法準(zhǔn)確地判斷出樣本的假陽性，HPLC-MS/MS方法同時能對獸藥殘留組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證得到藥物的分子結(jié)構(gòu)信息，從而有效避免結(jié)果的假陽性。但HPLC-MS/MS分析方法前處理比較復(fù)雜，所需的儀器價格昂貴，極大地限制了方法的推廣使用。

李佩佩等[14]建立了HPLC-MS/MS同時檢測水產(chǎn)品中14種喹諾酮類藥物的分析方法。進(jìn)行基質(zhì)固相分散凈化后經(jīng)液相色譜柱分離，以0.2%甲酸溶液和甲醇為流動相。14種喹諾酮類藥物的線性范圍0.50～20.0 μg/L，方法檢出限為0.4～1.0 μg/kg，加標(biāo)回收率為82%～90%。結(jié)合中國規(guī)定水產(chǎn)品中的喹諾酮類的MRLs，可以看出本方法完全滿足水產(chǎn)品中14種喹諾酮類藥物殘留的快速確證和定量分析。

2.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法操作簡單、色譜柱不受緩沖液的各種表面活性劑等添加劑的酸堿性影響，具有分離效率高、運行成本低等優(yōu)點，有利于實際樣品的分析。Wang等[28]建立了測定喹諾酮藥殘的毛細(xì)管區(qū)電泳方法。水產(chǎn)樣品在80 ℃和10.3 MPa下用乙腈作為溶劑進(jìn)行加速溶劑萃取，使用大容量樣品堆疊與極性轉(zhuǎn)換的柱前預(yù)濃縮，測定4個喹諾酮類定量限為13.2～20 μg/kg。添加水平為50、100和500 μg/kg時，其平均回收率為85.4%～95.7%，對蝦樣本的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.1%～4.7%，沙丁魚的RSD為1.4%～4.5%。該方法快速簡單，準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性令人滿意。表4為毛細(xì)管電泳法在水產(chǎn)品中喹諾酮類殘留檢測中的應(yīng)用情況。

表2 高效液相色譜法檢測水產(chǎn)品中的喹諾酮類殘留量Tab.2 Determination of quinolone residues in aquatic products by high performance liquid chromatography

表3 HPLC-MS/MS方法檢測水產(chǎn)品中喹諾酮類的殘留量Tab.3 Determination of quinolone residues in different aquatic products by HPLC-MS/MS method

續(xù)表3，Tab.3 Continued

表4 毛細(xì)管電泳法檢測水產(chǎn)品中的喹諾酮類殘留Tab.4 Determination of quinolone residues in aquatic products by capillary electrophoresis

3 結(jié)語

喹諾酮類抗菌藥因其在水產(chǎn)動物和魚類細(xì)菌性疾病的治療效果較好，價格低廉，已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病的治療中，但因不規(guī)范用藥造成的藥物殘留問題引起全世界關(guān)注。因此各國相繼制定了相關(guān)MRL，中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部(原農(nóng)業(yè)部)表現(xiàn)出了高度關(guān)注，在MRL設(shè)置方面與國際接軌。喹諾酮類藥物殘留檢測的研究越來越受到重視，其中HPLC方法具有較好的分離度、靈敏度及準(zhǔn)確度的特點，但對于多種喹諾酮殘留同時檢測時效果一般，前處理所需溶劑消耗量大，對環(huán)境污染嚴(yán)重；HPLC-MS/MS方法分析線性范圍較廣、特異性強(qiáng)及能準(zhǔn)確地對微量獸藥多種殘留組分同時分析，農(nóng)業(yè)部公告第1077號[32]水產(chǎn)品中15種喹諾酮類藥物殘留量的測定就是使用的本方法。但該設(shè)備價格昂貴，極大地限制了方法的推廣使用；毛細(xì)管電泳法具有進(jìn)樣量小、分離度高、分析成本低的優(yōu)點，但該法的缺點為檢出限較高。可以根據(jù)實驗所要研究的樣品基質(zhì)、對線性范圍及檢出限的要求選擇使用合理準(zhǔn)確的檢測方法。