紀(jì)瑩，胡楊，宋甲亮，陳會(huì)丹，李愛峰,2*

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院; 2. 教育部海洋環(huán)境與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室：山東 青島 266100)

海洋浮游植物是雙殼類軟體動(dòng)物、甲殼類動(dòng)物和魚類幼體必不可少的食物來源。然而，部分海洋浮游植物可產(chǎn)生有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物(被稱為“藻毒素”)，沿食物鏈傳遞并在貝類和魚類體內(nèi)積累(俗稱為“貝毒”或“魚毒”)，潛在威脅消費(fèi)者的身體健康和生命安全，制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織/政府間海洋學(xué)委員會(huì)(FAO/WHO/IOC)組成專家組，根據(jù)海洋貝毒的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將其劃分為8組，主要包括石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、軟骨藻酸(domoic acid，DA)、大田軟海綿酸(okadaic acid，OA)、蝦夷扇貝毒素(yessotoxin，YTX)、蛤毒素(pectenotoxin，PTX)、氮雜螺環(huán)酸(azaspiracid，AZA)、短裸甲藻毒素(brevetoxin，BTX or PbTx)和環(huán)亞胺類毒素(cyclic imine，CI)。除STX和DA 組毒素外，其他海洋毒素具有熱穩(wěn)定性，易溶解于有機(jī)溶劑，統(tǒng)稱為脂溶性貝毒(lipophilic shellfish toxins, LSTs)。這類毒素進(jìn)入貝類體內(nèi)后，容易在貝類脂肪內(nèi)富集而不易排出，且一般的加熱處理也不能降低其毒性，對(duì)消費(fèi)者帶來的潛在危害更難預(yù)防[1]。

目前用于貝類樣品毒素分析的檢測(cè)方法主要包括小鼠生物法(mouse bioassay, MBA)、酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)等方法。與其他方法相比，LC-MS/MS方法綜合了色譜的分離優(yōu)勢(shì)和質(zhì)譜的強(qiáng)大定性能力，具有靈敏度高、分辨能力強(qiáng)、能有效縮短檢測(cè)時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。此外，LC-MS/MS還能對(duì)新型未知毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)提供有價(jià)值的信息。本研究通過在中國(guó)沿海采集主要的養(yǎng)殖貝類，應(yīng)用LC-MS/MS方法同步分析OA、PTX-2、AZA1～3、YTX、鰭藻毒素-1(dinophysistoxin-1, DTX-1)，以及螺環(huán)內(nèi)酯毒素spirolide-1(SPX-1)、環(huán)亞胺毒素gymnodimine-A(GYM-A)和江珧毒素pinnatoxin-G(PnTX-G)共10種脂溶性貝毒，旨在揭示中國(guó)養(yǎng)殖貝類沾染脂溶性毒素的組分特征和分布規(guī)律，為中國(guó)沿海重要貝類養(yǎng)殖區(qū)的脂溶性貝毒的監(jiān)測(cè)預(yù)警工作和貝類質(zhì)量安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

在中國(guó)四個(gè)海區(qū)的沿海，選取10個(gè)具有代表性的沿海城市，分別是河北秦皇島、遼寧大連、山東榮成、山東青島、江蘇連云港、浙江舟山、浙江溫州、福建寧德、廣東深圳和廣西北海。于2016年3月下旬在各地海產(chǎn)品市場(chǎng)采集68份貝類樣品，根據(jù)貝殼的外形特征，對(duì)貝類樣品進(jìn)行種屬鑒定，共計(jì)31種貝類，具體采集情況及貝類名稱詳見表1。冰凍狀態(tài)下將樣品運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱中解凍后，用過濾海水清理表面的泥沙，放于冰袋上解剖，取出全部軟體組織并用濾紙吸干多余水分，再用組織攪拌機(jī)將貝類軟體組織(n≥3)絞碎混勻，將勻漿后的樣品(>20 g)置于50 mL離心管中，-20 ℃冰箱中保存。

脂溶性貝毒的提取過程參照Gerssen等[2]的方法，將勻漿后的貝類組織樣品從冰箱中取出解凍，使用分析天平準(zhǔn)確稱取1 g于10 mL離心管中，加入3 mL甲醇后渦旋混勻，3 840×g下離心10 min，離心后將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，再向離心管中加入3 mL甲醇并混勻，重復(fù)上述步驟2次，混合提取溶液并用甲醇定容至10 mL。使用1 mL注射器吸取毒素提取液，過0.22 μm有機(jī)系濾膜，轉(zhuǎn)入1.5 mL 進(jìn)樣瓶，-20 ℃冷凍保存直至LC-MS/MS分析。

1.2 儀器與試劑

主要儀器包括Agilent 1290高效液相色譜-6430三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent 公司)，BSA223S電子天平(德國(guó)Sartorius公司)，HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)，Stuart SA8渦輪振蕩混合器(英國(guó)BioCote 公司)和BCD-539WT冰柜(青島海爾股份有限公司)。

主要試劑包括OA、PTX-2、AZA-1、AZA-2、AZA-3、SPX-1、GYM-A、YTX、PnTX-G毒素標(biāo)準(zhǔn)品(加拿大國(guó)家研究院測(cè)量科學(xué)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，NRCC-MSS)和DTX-1毒素標(biāo)準(zhǔn)品(日本和光純藥株式會(huì)社，Wako)；甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó) Merck 公司)；氨水(優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(MilliQ水凈化系統(tǒng)制備，美國(guó)Millipore公司)。

1.3 LC-MS/MS分析方法

本研究采用10種脂溶性貝毒的同步檢測(cè)方法[2-3]，具體檢測(cè)步驟如下。

色譜柱采用X-BridgeTMC18柱(150 mm × 3 mm i.d., 5 μm，Waters)，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流速為300 μL/min[2]。流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為90%乙腈，流動(dòng)相A、B均含有6.7 mmol/L氨水(pH=11)。采用梯度洗脫程序，洗脫條件為：10%流動(dòng)相B保持1 min，在9 min內(nèi)升高至90%，并保持3 min；然后在2 min內(nèi)降低至10%流動(dòng)相B，保持3 min后結(jié)束，并進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)。

電噴霧離子化源霧化器壓力40 psi，源溫度110 ℃，干燥氣體(N2)溫度350 ℃，干燥氣體流速10 L/min，毛細(xì)管電壓4 000 V。ESI正負(fù)離子切換，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring, MRM)進(jìn)行定性和定量分析，每種毒素選擇兩種變遷離子模式，以子離子豐度高的變遷模式作為定量依據(jù)，以豐度較低的變遷模式輔助定性(表2)。該分析方法為本實(shí)驗(yàn)室建立的成熟測(cè)定方法，各毒素的檢出限和定量限均已經(jīng)過驗(yàn)證[3]。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂溶性貝毒的組成與含量

本次調(diào)查共采集31種養(yǎng)殖貝類，共計(jì)68份貝類樣品(表1)。應(yīng)用LC-MS/MS對(duì)10種脂溶性貝毒進(jìn)行同步檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品與樣品中毒素的色譜圖如圖1所示。在30份樣品中共檢出4種脂溶性貝毒，樣品檢出率為44.1%，YTX、PTX-2、SPX-1和GYM-A等毒素含量如表3所示。應(yīng)當(dāng)指出的是，PTX-2一般不是貝類樣品中的優(yōu)勢(shì)組分, 而經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化形成的PTX-2sa含量較高[4]；另有研究表明，超過90%的GYM毒素以酯化結(jié)合態(tài)的形式存在于貽貝的軟體組織中[5]。因此，在這些陽(yáng)性樣品中，可能還存在這4種毒素的同系物，如Homo-YTX、PTX-2sa和GYM-A 酯化結(jié)合態(tài)產(chǎn)物等，但受標(biāo)準(zhǔn)品的限制，本研究未對(duì)這些毒素的同系物進(jìn)行定性和定量分析。

表2 LC-MS/MS分析脂溶性貝毒的質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Parameters of mass spectrometry for lipophilic shellfish toxins

表3 貝類樣品中檢出毒素的含量Tab.3 Contents of LSTs in shellfish samples

續(xù)表3，Tab.3 Continued

續(xù)表3，Tab.3 Continued

圖1 LC-MS/MS分析脂溶性貝毒標(biāo)準(zhǔn)品(a)與貝類樣品中毒素(b)的色譜圖GYM-A: 環(huán)亞胺毒素;YTX: 蝦夷扇貝毒素;PTX-2: 蛤毒素; SPX-1: 螺環(huán)內(nèi)酯毒素。*表示貝類樣品中毒素的相對(duì)豐度擴(kuò)大20倍顯示。Fig.1LC-MS/MS chromatograms using basic mobile phase for standard reference materials of LSTs(a) and LSTs(b) in shellfish samples GYM-A: gymnodimine-A; YTX: yessotoxin; PTX-2: pectenotoxin-2; SPX-1: spirolide-1.*means relative abundance of toxins in the samples was magnified by 20 times.

本研究所分析的貝類樣品中，GYM-A 毒素的檢出頻率最高，在18份樣品中均有檢出，檢出率為26.5 %，含量為0.85～211.47 μg/kg。除連云港、青島和秦皇島外的7個(gè)城市采集的樣品，均含有GYM-A毒素，在采自南海(北海市和深圳市)的貝類樣品中均檢出不同含量水平的GYM-A毒素(1.16～211.47 μg/kg)，檢出率100%(6/6)。從地理分布的趨勢(shì)來看，采集自南海的貝類樣品含有的GYM-A的含量最高，其次是采集自東海的貝類樣品，黃海海域的部分站位采集的貝類也含有GYM-A。由此來看，養(yǎng)殖貝類樣品中GYM-A毒素的檢出率和含量在中國(guó)沿海由南向北依次降低。在10份樣品中檢測(cè)出SPX-1毒素，檢出率為14.7 %，含量為0.19～ 2.35 μg/kg。在采集自北海的樣品中，除文蛤(Meretrixlinnaeus)外均檢出較低含量的SPX-1，且在采集自北海、溫州、連云港和榮成的牡蠣(Crassostreasp.)樣品以及寧德的縱帶灘棲螺(Batillariazonalis)樣品中也有檢出。盡管這些貝類樣品中SPX-1 的檢出含量較低，但其檢出率較高，分布范圍較廣，應(yīng)給予高度重視。在9份樣品中檢測(cè)出PTX-2 毒素，檢出率為13.2%，除采集自大連的櫛孔扇貝樣品PTX-2的含量為6.16 μg/kg外，其他陽(yáng)性樣品的含量在0.55 ～1.54 μg/kg之間，但其分布范圍涵蓋中國(guó)的4個(gè)海區(qū)，這也說明產(chǎn)毒鰭藻在中國(guó)沿海廣泛分布。在7份樣品中檢測(cè)出YTX毒素，檢出率為10.3%，陽(yáng)性樣品主要分布在青島、秦皇島和大連3個(gè)城市，包括紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)、香螺(Nepharcapectinata)和櫛江珧(Atrinapectinata)等樣品，含量范圍為4.51～54.64 μg/kg。由此來看，YTX毒素污染主要分布在中國(guó)的北方海域，以渤海和北黃海為主。

目前，中國(guó)尚未對(duì)YTX、PTX、SPX及GYM在水產(chǎn)品中的限量標(biāo)準(zhǔn)做出明確規(guī)定[1]，參考?xì)W盟標(biāo)準(zhǔn)，YTX和PTX在鮮活貝類體內(nèi)的含量限值分別是1 000 μg/kg和160 μg/kg[6]，本研究中這兩種毒素在貝類樣品中的含量均未超出限量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)已有報(bào)道，中國(guó)沿海貝類樣品中GYM毒素的含量較低，均在50 μg/kg以下，甚至低于10 μg/kg[7-11]，然而本研究中檢測(cè)到樣品中GYM-A毒素的最高含量高達(dá)211.47 μg/kg，如果按照歐盟頒布的腹瀉性貝毒的食品安全控制標(biāo)準(zhǔn)(160 μg/kg)來評(píng)價(jià)GYM-A和SPX-1毒素，此次的調(diào)查樣品已出現(xiàn)GYM-A毒素超標(biāo)現(xiàn)象。

2.2 脂溶性貝毒的地理分布情況

本研究所檢出的4種脂溶性貝毒在中國(guó)沿海的分布情況如圖2所示。圖中給出了不同城市采集的貝類樣品所檢出毒素的最高濃度值，可以看出在春季采集的貝類樣品沾染的脂溶性貝毒以GYM-A 和YTX 為主，同時(shí)含有微量的PTX-2 和SPX-1。GYM是一組含有環(huán)狀亞胺、醚或聚醚大環(huán)結(jié)構(gòu)的天然有機(jī)化合物，主要通過介導(dǎo)阻斷乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor, AChR)產(chǎn)生毒性作用[12]。關(guān)于GYM毒性的研究結(jié)果表明，小鼠經(jīng)腹腔注射GYM-A毒素，獲得的半致死劑量(LD50)為80～96 μg/kg，且GYM-A的毒性約是GYM-B毒性的10倍；通過灌胃法染毒，GYM-A對(duì)小鼠的LD50值為755 μg/kg；以食物添加的方式給藥，在含量高達(dá)7 500 μg/kg時(shí)，小鼠仍未見中毒跡象且解剖后無病變[13]。采用腦室注射GYM的染毒方式，測(cè)得GYM-A的LD50值僅為3 μg/kg，其毒性接近腹腔注射染毒毒性的30倍[12]。由此來看，GYM-A首先影響嚙齒動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，且經(jīng)腹腔注射和灌胃方式染毒產(chǎn)生的毒性遠(yuǎn)高于經(jīng)口服途徑產(chǎn)生的毒性。但小鼠經(jīng)腹腔注射和灌胃法產(chǎn)生的高毒性，以及GYM對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒害作用，提示GYM毒素對(duì)海洋生物及人類健康的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。目前已知的GYM毒素來源主要是鞍狀凱倫藻(Kareniaselliformis)[14]。前期已有一些報(bào)道指出，中國(guó)沿海貝類中含有GYM[7-11]，且該毒素在枸杞島冬季和春季采集的養(yǎng)殖貝類中含量較高[9]。本研究結(jié)果表明，GYM-A廣泛分布于南海、東海和黃海海域，且在南部海域的檢出濃度和頻次較高。2014年，劉仁沿等[4]也曾指出中國(guó)南部海域采集的貝類樣品中含有GYM毒素，本研究在東海和黃海海域也檢測(cè)到GYM-A，說明該毒素具有更廣泛的分布區(qū)域。

圖2 貝類樣品中4種脂溶性貝毒在中國(guó)沿海的分布情況數(shù)值表示該地區(qū)樣品中毒素的最高含量。Fig.2 Distribution of LSTs in the coastal areas of China The values indicate the maximum level of each city.

YTX是一類巰基階梯形多環(huán)聚醚類有機(jī)化合物[15]，主要由網(wǎng)狀原角藻(Protoceratiumreticulatum)、多邊舌甲藻(Lingulodiniumpolyedrum)以及具刺膝溝藻(Gonyaulaxspinifera)產(chǎn)生[16-18]，并且在中國(guó)海域也曾發(fā)現(xiàn)這3種甲藻的孢囊[19]。盡管目前尚未明確YTX毒素對(duì)人體健康的致毒機(jī)制，但生物毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該毒素可能會(huì)對(duì)心臟、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞溶酶體和胸腺等造成不同程度的損壞，而且作用過程和機(jī)制非常復(fù)雜[20-21]。本研究?jī)H在采自秦皇島、大連和青島3個(gè)城市的貝類樣品中檢測(cè)出YTX，表明YTX主要分布于渤海和黃海海域，尤其是渤海和黃海北部。PTX是一類具有大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的多環(huán)醚類化合物[22]，專屬性地來源于鰭藻屬(Dinophysissp.)[23]，具有肝毒性，被稱為肝損傷性貝毒(hepatotoxic shellfish toxins, HST)。盡管在本次調(diào)查分析過程中僅檢出微量的PTX-2，但在渤海、黃海、東海和南海四大海域的樣品中均有檢出，其中含有PTX-2的貝類樣品主要是櫛孔扇貝、牡蠣和紫貽貝。SPX與GYM的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，同屬于環(huán)狀亞胺類(cyclic imine, CI)，主要由Alexandriumostenfeldii產(chǎn)生[24-25]。本研究中，在黃海、東海和南海采集的貝類樣品中含有微量的SPX-1(LOQ～2.35 μg/kg)，多數(shù)SPX染毒樣品中同時(shí)存在著GYM毒素(7/10)，推測(cè)其來源可能與奧氏亞歷山大藻(Alexandriumostenfeldii)有關(guān)。目前有關(guān)人因食用SPX染毒貝類引起的中毒事件顯示，中毒者并未出現(xiàn)特異性的癥狀，僅表現(xiàn)為胃腸不適和心跳過速[26]。小鼠生物毒性實(shí)驗(yàn)也顯示，經(jīng)腹腔注射SPX染毒的小鼠的海馬體和腦干神經(jīng)元均出現(xiàn)受損癥狀[27]，其對(duì)人神經(jīng)系統(tǒng)可能的毒害作用應(yīng)給予重視。需要說明的是，本研究只調(diào)查分析了春季采集的貝類樣品中毒素的分布狀況，存在季節(jié)的局限性，尚不能全面反映中國(guó)沿海養(yǎng)殖貝類脂溶性貝毒的污染特征，有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)采集自10個(gè)中國(guó)沿海城市的68份養(yǎng)殖貝類樣品，進(jìn)行脂溶性貝毒篩查。研究表明，2016年春季，中國(guó)沿海貝類所沾染的脂溶性貝毒中環(huán)亞胺毒素GYM-A和蝦夷扇貝毒素YTX含量較高，同時(shí)存在微量的蛤毒素PTX-2和螺環(huán)內(nèi)酯毒素SPX-1，GYM-A、YTX、PTX-2和SPX-1毒素在本批次樣品中的檢出率依次為26.5%、10.3%、13.2%和14.7%；GYM-A和SPX-1毒素主要分布在中國(guó)南部海域，且其分布范圍已擴(kuò)散至東海和黃海，YTX毒素則主要分布于渤海、北黃海海域，盡管PTX-2毒素在樣品中含量較低，但在中國(guó)四大海域均有分布。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)中國(guó)沿海貝類養(yǎng)殖區(qū)脂溶性貝毒產(chǎn)毒藻的監(jiān)測(cè)，在南海海域重點(diǎn)開展GYM與SPX毒素的監(jiān)測(cè)工作，在黃渤海海域重點(diǎn)監(jiān)測(cè)YTX與PTX毒素，對(duì)于保障海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展和保護(hù)消費(fèi)者健康具有重要科學(xué)意義。