韓慧宗，劉陽,2，王騰騰，張明亮，王斐，孫娜,2，姜海濱*

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院, 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室, 山東 煙臺 264006;2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

許氏平鲉(Sebastesschlegelii)，隸屬于鲉形目(Scorpaeniformes)、鮶科(Scorpaenidae)、平鲉屬(Sebastes)，俗稱黑鮶，是中國黃、渤海區(qū)常見的近海冷溫性底層巖礁經(jīng)濟(jì)魚類。由于其肉質(zhì)鮮美細(xì)膩，營養(yǎng)豐富，贏得了北方地區(qū)“黑石斑”的美譽(yù)，深受國內(nèi)外市場歡迎。同時具有洄游范圍小、抗病力強(qiáng)、生長速度快、可自然越冬等特點，已成為中國北方沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖、增殖放流、休閑垂釣和海洋牧場的重要魚種。許氏平鲉屬于卵胎生魚類，性成熟的雌雄親魚常在每年11月左右交尾，交尾后精子以“精囊”的形式儲存在雌魚卵巢內(nèi)，分布于輸卵管、卵巢膜以下等位置[1]，至翌年的4月中旬開始受精，胚胎在雌魚體內(nèi)發(fā)育，出膜后繼續(xù)發(fā)育，至5月左右產(chǎn)出自由活動的仔魚[2]。近二十年來，隨著自然采捕撈量的增加，許氏平鲉野生資源顯著減少，北方沿海開展了人工增殖放流工作[3-4]。由于市場消費(fèi)和優(yōu)良苗種需求量巨大，本課題組從2006年開始陸續(xù)開展了許氏平鲉良種選育工作。

許氏平鲉交配行為一般發(fā)生在晚上，不易觀察，初冠囡等[5]通過對雌親家系后代研究發(fā)現(xiàn)許氏平鲉存在“一雌多雄”的受精方式，而 “一雄多雌” 的受精方式目前仍沒有定論。同時，單條許氏平鲉成熟雌魚產(chǎn)仔量在10萬尾以上，有限數(shù)量親本就可以繁殖大量的后代群體，而參與交配的繁殖親本對后代貢獻(xiàn)的大小直接影響人工選育和放流群體遺傳多樣性[6]。Sugama等[7]對真鯛(Pagrusmajor)親本對子代貢獻(xiàn)率分析中也發(fā)現(xiàn)，只有不到30%的親本對后代基因庫有貢獻(xiàn)。陳睿毅等[8]用8雄5雌牙鲆親魚配組，結(jié)果親本貢獻(xiàn)率最高達(dá)到47.34%，最低僅為0.53%。親本對子代貢獻(xiàn)率不均衡通過累代繁殖，可能造成群體的遺傳多樣性降低。

在水產(chǎn)動物研究領(lǐng)域，微衛(wèi)星多重PCR技術(shù)因具有省時高效、低成本、高通量等優(yōu)點，能夠降低分型過程重復(fù)帶來的人工誤差[9]，已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物親子鑒定中，如大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[10]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[11]、長牡蠣(Crassostreagigas)[12]、紫菜(Porphyrahaitanensis)[13]等?；趩蝹€微衛(wèi)星位點對許氏平鲉群體遺傳分析、遺傳圖譜構(gòu)建等研究已得到應(yīng)用[14-15]，但目前尚未有關(guān)于許氏平鲉多重PCR體系的構(gòu)建及應(yīng)用的報道。本研究利用本課題組開發(fā)的13對高多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行優(yōu)化組合，建立了許氏平鲉3個三重PCR和2個兩重PCR反應(yīng)體系，對雌雄交尾成功的4個母本和所產(chǎn)家系及10個候選父本進(jìn)行親權(quán)鑒定，在檢測許氏平鲉親子鑒定準(zhǔn)確率的同時，分析其交配模式，計算不同父本對子代的貢獻(xiàn)率，旨在為許氏平鲉良種育種和苗種繁育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

于2016年10月，在煙臺泰華海洋科技有限公司選取健康并達(dá)到性成熟且性腺發(fā)育良好的雌、雄親魚各10尾，放養(yǎng)于工廠化室內(nèi)養(yǎng)殖池內(nèi)，通過控溫控光技術(shù)，讓其自由交尾。待到2017年4月底，雌、雄親魚未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，有4尾雌性親魚腹部隆起明顯，分別放于4個養(yǎng)殖池內(nèi)待產(chǎn)，于5月1日至5月3日三天內(nèi)分別產(chǎn)出自由游動的仔魚。樣品采集10個雄性親魚背鰭，編號為Ma1、Ma2、Ma3……Ma10，于7月份樣品采集4尾雌性親魚背鰭，編號為Fe1、Fe2、Fe3和Fe4，每尾雌魚所產(chǎn)后代為1個雌親家系(即半同胞家系)，每個雌親家系取子代94尾，均放置于75%無水乙醇中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。親魚培育水溫為自然海水水溫，仔魚培育水溫為14～20 ℃。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用傳統(tǒng)的飽和酚-氯仿-異戊醇法[14]進(jìn)行實驗樣品的基因組DNA提取。提取完成后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，通過分光光度計測定DNA濃度和純度，將DNA質(zhì)量濃度稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星候選標(biāo)記的篩選

從本課題組已開發(fā)的多態(tài)性較高且擴(kuò)增效果較好的微衛(wèi)星引物中挑選25對[4,14]。微衛(wèi)星引物由上海生工生物工程有限公司合成。以擴(kuò)增效率高、多態(tài)性高、雜帶較少、目的條帶清晰且不相重合為基本原則，挑選最優(yōu)的13對微衛(wèi)星引物用于多重PCR體系的構(gòu)建，PCR體系引物的位點組合、重復(fù)單元、堿基序列、產(chǎn)物大小、退火溫度如表1所示。

1.2.3 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含17.8 μL ddH2O，2.5 μL 10×PCR Buffer (Mg2+)，0.5 μL 10 mmol/L dNTPs，正反引物各1 μL，1 U Taq酶，2 μL模板DNA。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s、退火40 s、72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。PCR產(chǎn)物用8%非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，用10 bp DNA ladder標(biāo)記等位基因位置，使用銀染染色法染色，用Bio-5000 Pus掃描儀掃描電泳圖譜，擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段大小由Gel-Pro analyzer 32凝膠分析軟件定量。

1.2.4 微衛(wèi)星多重PCR優(yōu)化組合

根據(jù)各個微衛(wèi)星位點的退火溫度和PCR擴(kuò)增片段大小差異性，優(yōu)先利用兩個微衛(wèi)星位點的兩兩組合，同時選擇擴(kuò)增片段不重疊、退火溫度相近(溫差不超過5 ℃)、引物序列不出現(xiàn)錯配和引物二聚體的微衛(wèi)星位點進(jìn)行兩重PCR構(gòu)建。在此基礎(chǔ)上，加入第3個引物，篩選構(gòu)建三重PCR體系。通過對引物退火溫度、引物濃度比例、反應(yīng)體系等條件去優(yōu)化，確定最佳的反應(yīng)條件。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 實驗結(jié)果

2.1 許氏平鲉微衛(wèi)星多重PCR體系的建立

本研究利用13對微衛(wèi)星構(gòu)建了3個三重PCR和2個二重PCR體系。圖1示體系Multiplex Set4和Multiplex Set2在部分子代中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，目的條帶清晰且不重合、染色均勻、準(zhǔn)確性較高。結(jié)果表明，實驗構(gòu)建的微衛(wèi)星5組多重PCR可用于交配后代的親權(quán)鑒定分析和親本貢獻(xiàn)率研究。

表1 許氏平鲉5組微衛(wèi)星多重PCR特征Tab.1 The characteristics of 5 microsatellite multiplex PCRs in Sebastes schlegelii

2.2 許氏平鲉微衛(wèi)星位點的多態(tài)性分析

表2展示了5組多重PCR中13對微衛(wèi)星標(biāo)記在4個家系中的遺傳參數(shù)、排除率和累積排除率。等位基因數(shù)(Na)為6～13，觀測雜合度(Ho)為0.452～1.000，期望雜合度(He)為0.445～0.810;多態(tài)信息含量(PIC)為0.404～0.777，參照Botstein等[20]制定的標(biāo)準(zhǔn)顯示3個位點為中度多態(tài)性;其余均為高度多態(tài)性，無效等位基因頻率F(Null)為-0.300～0.014。在4個家系子代中平均等位基因數(shù)均為9，平均觀測雜合度依次分別為0.966、0.993、0.955和0.963，平均期望雜合度依次分別為0.733、0.751、0.698和0.678，平均多態(tài)信息含量依次分別為0.684、0.706、0.650和0.620。4個家系子代之間遺傳差異性不大，均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。

圖1 Multiplex Set4 (a)和Multiplex Set2 (b)在部分子代中的電泳圖譜Fig.1 The electrophorograms of Set4 and Set2 multiplex PCR systems in some offspring

表2 5組多重PCR在4個家系中的遺傳參數(shù)、排除率和累計排除率Tab.2 Genetic parameter, exclusion probability and cumulative exclusion probability of 5 multiple PCR systems in Sebastes schlegelii

續(xù)表2,Tab.2 Continued

2.3 親子鑒定的排除率和鑒定準(zhǔn)確率分析

由表2和圖2可以看出，鑒定4個家系時，雙親基因型已知的非親排除率(EP)分別介于0.250～0.445、0.205～0.395、0.232～0.506、0.267～0.438。當(dāng)使用3個三重PCR時累積排除率(CEP)依次分別為0.999 954 93、0.999 990 14、0.999 951 15和0.999 928 67，CEP>0.999 9，不能準(zhǔn)確找到父本的子代數(shù)依次分別為3、2、4和3個，親子鑒定準(zhǔn)確率依次分別為96.81%、97.87%、95.74%和96.81%；當(dāng)使用3個三重PCR和1個兩重PCR時CEP依次分別為0.999 996 92、0.999 998 82、0.999 995 95和0.999 992 01，CEP>0.999 99，不能準(zhǔn)確找到父本的子代數(shù)依次分別為1、1、2和2個，親子鑒定準(zhǔn)確率依次分別為98.94%、98.94%、97.87%和97.87%；當(dāng)使用3個三重PCR和2個兩重PCR時，CEP分別為0.999 999 73、0.999 999 93、0.999 999 65和0.999 999 27，CEP>0.999 999，4個家系均能找到相應(yīng)父本，親子鑒定準(zhǔn)確率均達(dá)到100%。

圖2 5組多重PCR在4個家系中的親權(quán)鑒定準(zhǔn)確率Fig.2 The accuracy rates of parentage assignment for 5 multiplex PCRs in four families

2.4 親子鑒定交配模式及父本貢獻(xiàn)率分析

在鑒定成功率100%的情況下，篩選出4個家系子代最有可能的父本，如表3和表4所示。Fe1家系中，鑒定出父本數(shù)為6個，分別為Ma2、Ma3、Ma4、Ma5、Ma7和Ma8；Fe2家系中，鑒定出父本數(shù)為5個，分別為Ma2、Ma3、Ma5、Ma7和Ma10；Fe3家系中，鑒定出父本數(shù)為4個，分別為Ma2、Ma4、Ma7和Ma10；Fe4家系中，鑒定出父本綜合數(shù)為3個，分別為Ma2、Ma6和Ma7。鑒定出許氏平鲉交配模式存在“一雌多雄”的現(xiàn)象。同時，Ma2和Ma7均參與到4個母本交配受精中，Ma3、Ma4、Ma5和Ma10均參與到2個母本交配受精中，所以也存在“一雄多雌”的交配模式。

在4個家系中，父本綜合貢獻(xiàn)率最高的父本分別為Ma7(32.45%)、Ma2(19.15%)和Ma6(16.22%)，其貢獻(xiàn)率總和達(dá)到67.82%，而Ma3、Ma10、Ma8、Ma4和Ma5五個父本貢獻(xiàn)率總和為32.18%。其中Ma1和Ma9未發(fā)現(xiàn)子代個體，說明未參與交配或交配受精不成功，其Ma1和Ma9綜合貢獻(xiàn)率為0。

表3 許氏平鲉4個家系的親子鑒定結(jié)果Tab.3 The numbers of parents corresponding to offsprings in the four groups

表4 許氏平鲉4個家系對應(yīng)父本的貢獻(xiàn)率Tab.4 The parental contribution rates of offsprings in the four groups

3 討論

3.1 許氏平鲉微衛(wèi)星多重PCR體系的構(gòu)建

理想的多重PCR反應(yīng)需要不同引物能在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行特異性擴(kuò)增，且要求擴(kuò)增引物的退火溫度相近、擴(kuò)增片段不發(fā)生重疊、非特異性擴(kuò)增條帶不存在或較少，與單個位點PCR相比，多重PCR技術(shù)難度較大，需要對目的條帶和反應(yīng)條件進(jìn)行反復(fù)實驗、反復(fù)調(diào)整，最終得到最優(yōu)的反應(yīng)條件。但構(gòu)建成功以后，能節(jié)省實驗材料，提高效率，簡化操作步驟[17]。本研究在構(gòu)建許氏平鲉微衛(wèi)星PCR體系時發(fā)現(xiàn)，引物組合、引物濃度比例和退火溫度是影響多重PCR構(gòu)建成功的主要因素之一，這與李東宇等[11]和張毅等[18]的研究結(jié)果相一致。首先，不同引物間組合選擇在PCR擴(kuò)增時要避免形成二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成；其次，退火溫度選擇盡量相近或相差不超過5 ℃[19]，本研究的每重PCR均采用相同的退火溫度，在此溫度下引物均可有效擴(kuò)增；再次，引物濃度比例直接影響多重PCR的擴(kuò)增效率，過大會導(dǎo)致雜帶或二聚體的產(chǎn)生，過小會影響PCR產(chǎn)物的形成[20]?；谝陨戏矫?，本研究在建立二重PCR基礎(chǔ)上，再引入另外1個位點，經(jīng)反復(fù)實驗，直至得到最優(yōu)多重PCR組合，構(gòu)建了3個三重PCR體系。本研究構(gòu)建的3個三重PCR體系和2個二重PCR體系，條帶清晰，無重合條帶，適用于許氏平鲉的親子鑒定。

3.2 許氏平鲉家系遺傳多樣性和親權(quán)分析

親權(quán)鑒定準(zhǔn)確率與高多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量、待測親本與子代數(shù)量有關(guān)，通過使用高多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記或增加標(biāo)記數(shù)量可以提高準(zhǔn)確性[22]，同時微衛(wèi)星標(biāo)記準(zhǔn)確性還與無效等位基因存在有關(guān)[23]。Dakin等[24]指出只要無效等位基因頻率小于0.2，對結(jié)果產(chǎn)生的影響不會太大，只會稍微降低引物的累積排除率。本研究中所用的微衛(wèi)星位點的無效等位基因頻率均小于0.05。本研究是基于最大似然法的親本分析軟件Cervus，通過累積排除率(CEP)來評價該親權(quán)鑒定體系成立與否，累積排除率越高，親子鑒定率就會越高。參照人類親子鑒定標(biāo)準(zhǔn)，CEP達(dá)到99.95%即可做親子鑒定[25]；王敏[26]研究表明CEP≥99.73%時，即可認(rèn)定存在親子關(guān)系。本研究中通過3個三重PCR和1個兩重PCR鑒定時CEP均達(dá)到0.999 99以上，但不能有效鑒定父本數(shù)仍有1、1、2和2個。當(dāng)增加1個多重PCR時4個家系的累積排除率均達(dá)到0.999 999以上，均能找到父本鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到100%。這一結(jié)果與陳亮等[27]等利用5組多重PCR技術(shù)對長鰭吻鮈(Rhinogobioventralis)親子鑒定的結(jié)果相似,表明構(gòu)建的許氏平鲉微衛(wèi)星多重PCR反應(yīng)體系具有很好的可靠性和適用性。

3.3 許氏平鲉的交配模式及父本貢獻(xiàn)率分析

水產(chǎn)動物的交配行為因受自然條件的影響、交配時間不確定性或者交配隱秘不易發(fā)現(xiàn)，同時觀察到的交配行為并不代表受精成功。隨著分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于親本與子代間的親緣關(guān)系的鑒定，其交配模式研究結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。本研究利用構(gòu)建的微衛(wèi)星多重PCR對交尾受精成功的4組許氏平鲉親本和子代樣品進(jìn)行親權(quán)鑒定，結(jié)果顯示，4個家系子代的父本數(shù)為6、5、4和3個，證明了許氏平鲉存在“一雌多雄”的交配模式，與Gao等[28]對許氏平鲉野生和養(yǎng)殖群體的多重父權(quán)分析結(jié)果相一致。此交配模式在卵胎生魚類，如孔雀魚(Poeciliareticulata)[29]、食蚊魚(Gambusiaaffinis)[30]、褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)[31]中，均存在。本研究還發(fā)現(xiàn)，有2個父本均參與到4個雌性交配受精過程中，有4個父本分別參與了2雌性交配受精過程中，所以也存在“一雄多雌”的交配模式。一雌多雄交配模式能有效提高子代遺傳多樣性和繁殖效率，應(yīng)對環(huán)境異常變化[32]。

本研究表明父本對子代的貢獻(xiàn)率差異較大，4個家系子代中Ma2、Ma6和Ma7父本貢獻(xiàn)率較高，其總和達(dá)67.82%，遠(yuǎn)超其他父本的貢獻(xiàn)率，說明參與交配并成功受精的精子多數(shù)來自這3個父本；而Ma1和Ma8貢獻(xiàn)率卻為0，說明Ma1和Ma8未參與交配或交配后未參與受精。貢獻(xiàn)率大小的差異是由交配后精子競爭機(jī)制導(dǎo)致，精子競爭是指兩個或多個精子為爭奪與同一卵的受精權(quán)而競爭，是一種交配后的性選擇機(jī)制。由于許氏平鲉雌雄形成熟不同步(雌性比雄性晚)，且交配受精后存在精子儲存現(xiàn)象，精子儲存使得雌雄交配與精卵受精分離，不僅延長了雌性的繁殖周期，也有利于精子競爭及雌性隱性選擇，為交配后性選擇提供有利條件[33]。劉文芬等[34]研究短蛸(Amphioctopusfangsiao)交配模式時發(fā)現(xiàn)也存在交配后性選擇現(xiàn)象。另外，在許氏平鲉遺傳選育的過程中，親本對子代貢獻(xiàn)率不均衡也可能會導(dǎo)致一些等位基因的丟失，累代交配繁殖后造成后代遺傳多樣性降低。在許氏平鲉人工交尾進(jìn)行繁育和選育時要關(guān)注有效的繁殖親本，還要關(guān)注貢獻(xiàn)率的差異，及時發(fā)現(xiàn)無效或貢獻(xiàn)率低下的親本，及時剔除或補(bǔ)充新個體。

4 結(jié)論

本研究利用13對許氏平鲉微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了3個三重和2個兩重PCR體系，有效鑒定許氏平鲉4個家系的親權(quán)關(guān)系，累積排除率均達(dá)到0.999 999以上，鑒定成功率100%，鑒定到父本數(shù)為3～6個。研究發(fā)現(xiàn)許氏平鲉存在“一雌多雄”和“一雄多雌”的交配模式，父本貢獻(xiàn)率差異較大，Ma2、Ma6和Ma7父本貢獻(xiàn)率總和達(dá)67.82%，Ma1和Ma8貢獻(xiàn)率為0。本研究為許氏平鲉良種選育和人工繁育提供科學(xué)理論依據(jù)，也為卵胎生魚類交配后性選擇機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。