陳漢澤， 李進(jìn)偉， 師 含， 滕偉禹， 田 力

溶酶體組織蛋白酶通過影響β淀粉樣蛋白(Amyloid-β,Aβ)的代謝從而參與了老年癡呆癥(Alzheimer’s disease,AD)的發(fā)展進(jìn)程[1]，但姜黃素(curcumin)對于其中組織蛋白酶B (Cathepsin B,Cat B)在外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)與AD進(jìn)展的關(guān)系之前未有文獻(xiàn)報道，本研究將Aβ1-42微量注射至大鼠右側(cè)海馬制作AD動物模型，經(jīng)姜黃素處理后檢測模型大鼠外周血單個核細(xì)胞中Cat B表達(dá)及活性變化，同時監(jiān)測其行為學(xué)改變；探討姜黃素對外周血免疫細(xì)胞中Cat B的作用，試圖尋找姜黃素對于AD治療作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 Aβ1-42(Sigma)、姜黃素(Sigma，純度>96%)。Morris水迷宮、腦立體定位儀(日本成茂公司)。DEPC、Trizol(Invitrogen)，Taq酶、dNTP、隨機(jī)引物(TaKaRa)，引物DH5α感受態(tài)菌、瓊脂糖、大鼠CathpesinB、GAPDH測序引物及Taqman探針(上海生工)，Aβ1-42、兔抗Aβ1-42多克隆抗體(Anaspec)，兔抗Cathpesin B多克隆抗體(Santa)，l640細(xì)胞培養(yǎng)基(invitrogen)，Cathepsin B Activity Assay Kit (BioVision)。其它常規(guī)試劑購自沈陽化學(xué)試劑采購供應(yīng)站。定量PCR所用引物及探針序列(見表1)。

1.2 動物分組 健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～280 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，經(jīng)Morris水迷宮測試，4個象限測試中有2個象限超過2 min未找到安全平臺者視為記憶障礙被淘汰。剩余30只大鼠被隨機(jī)分為3組，每組10只，即假手術(shù)組、AD模型組和姜黃素干預(yù)組，其中5只用于外周血檢測，另外5只用于行為學(xué)檢測。

1.3 Aβ1-42致大鼠認(rèn)知障礙模型的制備及給藥 用無菌生理鹽水將Aβ1-42稀釋成10 μg/μl，37 ℃下孵育1 w，使其變?yōu)榫奂瘧B(tài)Aβ。大鼠常規(guī)吸入麻醉后固定于立體定位儀上，顱頂部正中切開皮膚，根據(jù)George Paxinos等1998年版《大鼠腦立體定位圖譜》選擇右側(cè)海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)，于前囟向后3.0 mm，中線旁開2.2 mm處，鉆開顱骨，微量進(jìn)樣器自腦表面垂直進(jìn)針2.8 mm，將Aβ1-42緩慢注入(10 μl)，留針10 min以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針，假手術(shù)組注入等體積PBS。干預(yù)組于建模后給予300 mg/(kg·d)二甲基亞砜溶解的姜黃素，連續(xù)腹腔注射7 d，假手術(shù)組、AD模型組大鼠分別腹腔注射等量二甲基亞砜。各組術(shù)后均單籠飼養(yǎng)至大鼠完全清醒。術(shù)后第9天腹腔麻醉心臟采血5 ml并分離單個核細(xì)胞；另一半動物同時進(jìn)行行為學(xué)測試。

1.4 實(shí)時定量PCR方法各組外周血單個核細(xì)胞中Cat B基因表 采用Taqman探針相對定量法，以GAPDH作為歸一化Cat B的持家基因。以構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，以質(zhì)粒初始模板絕對量的對數(shù)作橫坐標(biāo)、Ct值作縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以“目的基因初始模板量/GAPDH初始模板量”比值代表每個標(biāo)本目的基因的mRNA表達(dá)水平的相對量。每個標(biāo)本重復(fù)檢測兩次，結(jié)果取均值。抽提對照組、AD模型組及姜黃素干預(yù)組(n=5)外周血單個核細(xì)胞的cDNA與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行RT-qPCR，擴(kuò)增Cat B和GAPDH，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各標(biāo)本Cat B初始模板量與GAPDH初始模板量比值。

1.5 Morris水迷宮行為學(xué)測試 對照文獻(xiàn)方法[2]，于術(shù)后第9天，各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測定學(xué)習(xí)記憶能力。

1.5.1 定位航行試驗(yàn) 通過對訓(xùn)練大鼠游泳尋找平臺，觀測其逃避潛伏期長短可檢測動物的學(xué)習(xí)能力。歷時5 d，2次/d，將大鼠面向池壁分別從2個入水點(diǎn)放入水中，記錄其在2 min內(nèi)尋找到平臺的時間(逃避潛伏期，escape latency)和游泳路徑。如果大鼠在2 min未找到平臺，潛伏期記為120 s，并由實(shí)驗(yàn)者用木棒牽引其至平臺上，讓大鼠停留10 s，再放回籠中。

1.5.2 空間探索試驗(yàn) 第6天撤除平臺，任選一個入水點(diǎn)放入水中，記錄2 min內(nèi)大鼠在池中的游泳軌跡和時間，分別計算在各象限所停留時間的百分比。

1.6 單個核細(xì)胞中Cat B活性測定 如前分別于術(shù)后第9天采集外周血并分離單個核細(xì)胞，采用活性試劑盒檢測其活性。操作過程按說明書，以相對熒光單位(RFU)表示蛋白酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對于大鼠外周血單個核細(xì)胞中Cat B表達(dá)的影響 定量PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組及AD模型組相比，姜黃素干預(yù)組外周血單個核細(xì)胞中Cat B mRNA表達(dá)水平均上調(diào)(P<0.05，見圖1)。

2.2 姜黃素對于大鼠外周血單個核細(xì)胞中Cat B活性的影響 蛋白活性分析結(jié)果顯示，與對照組及AD模型組相比，姜黃素干預(yù)組外周血單個核細(xì)胞的Cat B活性提高(P<0.01，見圖2)。

2.3 AD模型大鼠在Morris水迷宮中定向航行和空間探索試驗(yàn)的表現(xiàn) 各組大鼠平均逃避潛伏期隨著游泳時間的延長而縮短，說明各組大鼠在5 d的游泳訓(xùn)練期間學(xué)習(xí)尋找平臺的能力逐次提高。組間兩兩比較顯示:從第2天開始，AD模型組平均逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(P=0.014)；姜黃素干預(yù)組與AD模型組相比，平均逃避潛伏期明顯縮短(P=0.026，見表2)。

表1 定量PCR所用引物及探針序列

注：Taqman 探針5’端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)FAM;3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA

表2 各組大鼠定向航行試驗(yàn)平均逃避潛伏期

與對照組比較*P>0.05；與AD組比較#P<0.05

圖1 姜黃素對大鼠外周血單個核細(xì)胞中Cat B mRNA表達(dá)的影響

圖2 姜黃素對大鼠外周血單個核細(xì)胞Cat B 活性的影響

3 討 論

AD是引起老年人群癡呆的最主要原因,其病因、發(fā)病機(jī)制不清，尚無確切治療方法[3]。近年來研究結(jié)果顯示外周獲得性免疫反應(yīng)與AD的發(fā)病及進(jìn)展相關(guān)，Aβ1-42在腦內(nèi)沉積、引發(fā)神經(jīng)元凋亡是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，對于Aβ清除能力的下降是疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因[4～6]。

Cat B是蛋白酶家族成員，在哺乳動物細(xì)胞溶酶體內(nèi)主要體現(xiàn)蛋白水解活性，能夠降解以內(nèi)吞或吞噬的方式進(jìn)入到內(nèi)體/溶酶體的蛋白及多肽。研究顯示[7,8]：Cat B及Cat D活性失調(diào)可能導(dǎo)致年齡相關(guān)的病理變化，包括自噬體的聚集以及脂褐質(zhì)的形成均導(dǎo)致神經(jīng)功能失調(diào)等損傷。同時細(xì)胞內(nèi)未水解產(chǎn)物的不斷聚集也增加了細(xì)胞的抗氧化壓力。動物體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)[7]：Cat B有助于APP小鼠腦內(nèi)斑塊的清除；同時有研究證實(shí)Cat D在AD患者外周血單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及皮膚成纖維瘤細(xì)胞中表達(dá)均下調(diào)[9～11]。但Cat B在大鼠腦內(nèi)注Aβ1-42后外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)情況及姜黃素對其表達(dá)的影響尚未見文獻(xiàn)報道。

姜黃素具有抗腫瘤、抗炎、抗HIV、抗菌、抗氧化等多種藥理作用，是從植物姜黃根莖中提取的一種酚類化合物，它可以通過抗氧化和抗炎等作用改善糖尿病等代謝性疾病、自身免疫疾病、動脈粥樣硬化等多種疾癥[12]。本實(shí)驗(yàn)以腦內(nèi)注入Aβ1-42誘導(dǎo)制作的AD模型大鼠為研究對象，檢測姜黃素對大鼠外周血單個核細(xì)胞中Cat B表達(dá)的作用及對于認(rèn)知功能的影響，探討姜黃素對AD的防治作用。

通過定量PCR方法顯示：大鼠腦內(nèi)注入Aβ1-42后外周血中Cat B表達(dá)無明顯變化，但姜黃素干預(yù)后AD模型組外周血單個核細(xì)胞中Cat B mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)。為進(jìn)一步探討Cat B表達(dá)上調(diào)的同時是否伴有酶活性的改變，我們?nèi)缜胺謩e采集對照組、AD模型組及姜黃素干預(yù)組外周血并分離單個核細(xì)胞，采用活性試劑盒檢測其活性，結(jié)果顯示：姜黃素干預(yù)后AD模型組單個核細(xì)胞中Cat B活性明顯提高。行為學(xué)分析結(jié)果也說明：和假手術(shù)組相比，Aβ1-42誘導(dǎo)的AD模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退，也說明AD動物模型造模成功。而姜黃素干預(yù)處理后，平均逃避潛伏期較AD模型組明顯縮短(P=0.026)。即姜黃素對改善認(rèn)知功能障礙大鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力的改善有一定促進(jìn)作用。

動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明[13,14]：姜黃素可以抑制AD小鼠腦內(nèi)Aβ的沉積，甚至使已經(jīng)沉積的神經(jīng)纖維斑塊體積變??；APP/PS1大鼠腦組織、血清中TNF-α和IL-6水平升高，姜黃素處理后血清TNF-α和IL-6等炎性細(xì)胞因子水平降低。這些研究結(jié)果均說明姜黃素具有抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用。

目前AD的治療僅限于藥物對癥療法，未能有效延緩病程進(jìn)展，同時因價格昂貴及副作用明顯等原因應(yīng)用范圍有限。中藥以其多靶位、低毒性的特點(diǎn)在改善和延緩早期輕度認(rèn)知損害等方面顯示出較好的療效。本實(shí)驗(yàn)研究表明姜黃素在改善AD認(rèn)知功能方面具有良好效果，為AD治療提供新思路。接下來將進(jìn)一步深入研究姜黃素通過影響Cat B表達(dá)在改善AD大鼠行為學(xué)表現(xiàn)的作用機(jī)制。