王友令，袁小遠，孟 凱，張玉霞，徐懷英，李 莉，亓麗紅，宋敏訓，艾 武

（山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，濟南 250100）

禽流感是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引發(fā)的具有高度接觸傳染性的病毒病。眾所周知，可以導致養(yǎng)禽業(yè)的巨大經(jīng)濟損失，同時還嚴重影響人類公共衛(wèi)生安全，其危害性不容小視[1]。禽類感染AIV后，癥狀可表現(xiàn)為呼吸道感染、蛋雞產(chǎn)蛋量下降明顯，最后部分病禽表現(xiàn)為急性全身致死性感染死亡[2]。H9亞型AIV的死亡率低，但可造成免疫抑制和產(chǎn)蛋量下降，引起養(yǎng)禽業(yè)巨大的經(jīng)濟損失。

H9N2亞型AIV目前已呈世界性分布，根據(jù)分布不同可分為北美和歐亞兩個種系[3]。我國于1994年首次公開報道該病的出現(xiàn)[4]。AIV的HA蛋白是A型流感病毒致病性的主要影響因子[5,6]；NA蛋白則能識別受體唾液酸殘基并介導病毒進入細胞[7]。為了解 2016年山東地區(qū) H9N2 亞型AIV的HA和NA 基因的變異和重組情況，我們選取分離的10株代表性分離株，對其HA和NA基因進行測序，分析其關鍵位點是否發(fā)生變化，探討基因遺傳演化規(guī)律，為山東地區(qū)H9N2 AIV的防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 毒株 10株 H9N2亞型AIV流行株由山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所分離鑒定保存，方法參照文獻[1]。10株毒株依次為A/CK/SD/XT31/2016/H9N2、A/CK/SD/XT33/2016/H9N2、A/CK/SD/XT34/2016/H9N2、A/CK/SD/XT35/2016/H9N2、A/CK/SD/XT39/2016/H9N2、A/CK/SD/XT43/2016/H9N2、A/CK/SD/XT44/2016/H9N2、A/CK/SD/XT46/2016/H9N2、A/CK/SD/MHS3/2016/H9N2、A/CK/SD/MHS5/2016/H9N2。

1.2 雞胚試劑 SPF雞（胚）由山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所SPF雞研究中心提供。分子生物學試劑均購自大連寶生物有限公司。

1.3 引物合成 利用Oligo6.0軟件設計了2對引物，由華大基因公司合成，用于擴增HA、NA基因全長序列，預期擴增的HA、NA基因大小為1687 bp、1402 bp。

表1 擴增所用引物Table 1 The primers for amplification

1.4 病毒RNA的提取及RT-PCR擴增、序列測定 按照Trizol試劑盒說明書提取病毒RNA，RT-PCR擴增、PCR產(chǎn)物連接克隆、序列測定按照文獻[7]進行。

1.5 遺傳進化分析 10株分離毒株和GenBank上已發(fā)表的8株H9N2 AIV的HA、NA基因序列（毒株具體信息及登錄號詳見表2），用MEGA5.0 分別進行遺傳演化分析，繪制系統(tǒng)進化發(fā)育樹。

表2 參考毒株的基本信息Table 2 The information of H9N2 AIV strains

2 結果

2.1 HA基因的分子特征、同源性和遺傳分析 10株H9N2分離株與參考毒株的HA氨基酸序列進行遺傳演化分析，繪制的進化樹見圖1。從進化樹可以看出，所有毒株分屬為3大分支：BJ94、Y439、G1。10株分離的AIV遺傳距離很近，都屬于BJ94大分支的G57小分支。10個分離株與BJ94參考毒株HA核苷酸同源性為89.1%～91.3%，氨基酸同源性為90.0%～93.4%；而10株分離株間的HA核苷酸同源性為94.1%～99.8%，氨基酸序列同源性為94.3%～100%。

圖1 HN基因遺傳進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of HA genes of isolated AIVs

所有分離株的HA裂解位點均為RSSR↓GLF，為弱毒株的序列特征。同時，分離毒株有6～8個潛在的糖基化位點，其中XT39毒株在218～220位和313～315位出現(xiàn)糖基化位點雙缺失。10株分離株191位的構成HA唾液酸受體結合位點的氨基酸為N（天冬酰胺），與經(jīng)典的禽流感國內(nèi)分離株的特征一致，非常保守。10株分離株中有3株在198位上變異為A（丙氨酸），6株變異為T（蘇氨酸），1株變異為M（甲硫氨酸）。10株分離毒在234位受體結合位點均為L（亮氨酸），也就是具有了與哺乳動物唾液酸α,2-6受體結合的特征。從進化樹分析可知，10個分離株同屬于歐亞分支中的A/Chicken/Beijing/1/1994亞群，與近年在中國的雞群中流行的由A/Chicken/Zhejiang/HJ/2007為代表的新的基因型（G57分支）遺傳關系最近[8]，推測是由其進化演變而來。

2.2 NA 基因同源性和遺傳分析 NA氨基酸序列進化樹如圖2。從進化樹可以看出，所有毒株分屬為3大分支：Y280、Y439、G1。10株分離毒株遺傳距離很近，都屬于Y280大分支的G57小分支。2007 年以來的 H9N2 毒株的NA 基因有相近的同源性關系。10個分離株與近年在中國的雞群中流行的G57分支遺傳關系最近。

所有分離株之間NA核苷酸序列同源性為94.9%～100%，氨基酸的同源性為94.2%～100%；此外，10個分離株與G57分支的NA核苷酸同源性為93.4%～94.4%，氨基酸的同源性為92.7%～94.4%。

分析特殊位點可知，分離的AIV的 NA莖部有不同長度氨基酸的缺失，即頸部均有9個核苷酸（3個氨基酸）的缺失。此外，血凝素結合HB位點第367均為賴氨酸（K）；而368 位，1株為天冬氨酸（D），其余均為天冬酰胺（N）；369位均為甘氨酸（G）。

3 討論

AIV的HA 蛋白是病原致病性和毒力的主要影響因子，尤其是HA裂解位點氨基酸序列是毒力的決定要素之一。本研究中10個毒株HA基因裂解位點氨基酸序列為RSSR↓GLF，也就是非多個連續(xù)堿性氨基酸，因此具有低致病性病毒分子特征。已發(fā)現(xiàn)流感病毒表面血凝素 HA蛋白上第226 位氨基酸是關鍵的受體結合位點，與病毒的受體結合特性和宿主特性相關[8]。本研究中10個毒株的HA受體結合位點只有第149、198、234位氨基酸存在變異。10株分離株中有3株在198位上變異為A（丙氨酸），6株變異為T（蘇氨酸），1株變異為M（甲硫氨酸）3種形式。另外有9株病毒在313位氨基酸處出現(xiàn)了一個新的潛在的糖基化位點，這一新糖基化位點出現(xiàn)是否參與病毒的感染尚未知。

NA 能識別受體唾液酸殘基并介導病毒進入細胞，NA存在6個潛在的糖基化位點[9]。近年來，國內(nèi)陸續(xù)分離到NA上糖基化位點缺失或突變的毒株，但是氨基酸缺失或突變是否影響NA功能未知。

Sun等[10]發(fā)現(xiàn)，同一時期不同地區(qū)H9N2病毒株之間同源性較高；不同的是，較早期病毒均有不同程度的變異和進化。楊婧等[11]發(fā)現(xiàn)，H9N2 HA和NA基因的變異情況與地域無相關性，但是與時間有部分的相關性。本研究中，從進化樹分析可知，10株H9N2分離毒 HA 和 NA 基因呈現(xiàn)出相近的同源性關系。

圖2 分離毒株的NA氨基酸進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of NA of isolated AIVs

H9N2 AIV對公共安全也有潛在威脅。2003年香港出現(xiàn)的感染人類的H9N2禽流感毒株HA蛋白的226位為L，而從家禽體內(nèi)分離的毒株為谷氨酸（Q）[12]。本研究10株 H9N2 AIV HA蛋白的226 位為L，呈現(xiàn)出典型的人流感受體結合特性。因此，我們需要加強重視低致病性AIV的潛在風險，避免其產(chǎn)生嚴重的公共危害。