王 巍，烏云塔娜，格根塔娜，劉連發(fā)，田宗民，邱 凱，蘇日古格，賈長生，王冠玉，趙忠武

（1.內(nèi)蒙古呼倫貝爾市獸醫(yī)科學(xué)研究所，呼倫貝爾 021000；2.新巴爾虎右旗動物疫病預(yù)防控制中心，新巴爾虎右旗 021300；3.海拉爾區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，海拉爾 021000）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）感染能夠引起動物多種疾病，包括牛出血性敗血癥、羊地方性流行性肺炎、豬萎縮性鼻炎、禽霍亂等，并可以引起人類疾病[1,2]。Pm呈世界性分布，對動物的致病率和死亡率均較高。根據(jù)莢膜抗原和脂多糖的不同，可將多殺性巴氏桿菌（Pm）分為5個血清群（A、B、D、E、F）和16個血清型（1～16）。我國有A、B、D 3個血清群，其中豬以5∶A型、6∶B型為主，牛羊以6∶B型最多，家禽以5∶A最多[3]。Pm不同莢膜血清型菌株之間交叉保護(hù)率較低，且各菌株在流行病學(xué)、毒力、生物學(xué)特征等方面的差異顯著[4]，因此準(zhǔn)確快速地鑒定莢膜血清型以及找到地方性流行株的敏感藥物是預(yù)防和控制巴氏桿菌病的關(guān)鍵。

羊巴氏桿菌病又稱羊鼻疽、羊出血性敗血癥，常呈地方流行，多發(fā)生于春、秋季節(jié)[5,6]。內(nèi)蒙古呼倫貝爾是我國養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)地區(qū)之一，隨著羊養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，全市羊巴氏桿菌病的發(fā)病率呈上升趨勢，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究以呼倫貝爾市地區(qū)鄂溫克旗兩個羊場出現(xiàn)的體溫升高、精神沉郁、食欲廢絕、頸向前伸、咳嗽、腹瀉、鼻孔有出血甚至死亡的病羊?yàn)檠芯繉ο?，采集病變組織，利用細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)鑒定技術(shù)[7,8]和Townsend等[9]建立的多殺性巴氏桿菌定種的PCR鑒定方法，鑒定多殺性巴氏桿菌及其莢膜血清型，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)找到針對流行株的敏感藥物，為本地區(qū)羊呼吸道疾病病原種類的確定、研制針對性疫苗以及診斷技術(shù)的研究提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2份羊肺組織病料均采集自呼倫貝爾市鄂溫克族自治旗，編號EY1，EY2。

1.1.1 臨床癥狀 EY1為2017年5月送檢的病死種公羊。其來源的羊場已死亡7只羊，部分病羊主要表現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、食欲廢絕、頸向前伸、咳嗽、腹瀉、鼻孔有出血、眼結(jié)膜潮紅、有的頸部發(fā)生水腫，病程為2～5 d。個別羊突然發(fā)病，全身寒戰(zhàn)、虛弱、呼吸困難并伴有抽搐等癥狀，數(shù)小時內(nèi)死亡。EY2為2017年7月送檢病死羊，其來源的羊場已死亡30只左右，病羊主要表現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、食欲廢絕、腹瀉、口中有白沫，用驅(qū)蟲、退燒藥等均無效。

1.1.2 剖檢變化 通過對送檢病羊進(jìn)行剖檢，EY1呈急性死亡，器官病變不明顯。EY2可見胸腔內(nèi)有黃色積液，肺淤血、充血、水腫、有小出血點(diǎn)和肝變，脾臟腫大且邊緣不齊，胃腸道有出血性炎癥；心臟蒼白、質(zhì)地柔軟。

1.2 試劑 酵母提取粉、胰蛋白胨均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；革蘭氏染色液、瑞士染色液購自南京建成科技有限公司；DNA Marker2000、HotMaster Taq DNA Polymerase、細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；抗菌藥物藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)室鏡檢 取新鮮無菌病死羊肺組織進(jìn)行涂片、干燥、固定，用革蘭氏染色法和瑞士染色法染色鏡檢，觀察形態(tài)特征。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng) 取新鮮無菌病料劃線接種于LB血瓊脂平板固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況，并將疑似菌落進(jìn)行染色鏡檢。同時取新鮮無菌病料劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基。

1.5 細(xì)菌DNA提取 挑取LB血瓊脂平板上單個菌落，接種于5%胎牛血清LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200r/min，震蕩孵育18～24 h；取2 mL培養(yǎng)菌液 2500×g離心10 min，棄上清；采用細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。

1.6 Pm雙重PCR鑒定 參考Townsend等[9]合成的Pm種特異性基因KMT1引物以及A 群、B群、D群、E群、F群的莢膜血清型特異性基因引物（表1），引物由北京華大基因生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將提取的肺組織基因組 DNA 作為 PCR 擴(kuò)增的模板，先用鑒定巴氏桿菌引物KMT1擴(kuò)增待檢樣品，然后利用鑒定其莢膜血清型引物capA、capB、capD、capE、capF進(jìn)行雙重PCR，擴(kuò)增目標(biāo)序列。兩輪PCR反應(yīng)體系及條件一樣，采用50 μL反應(yīng)體系：其中上下游引物各2 μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 4 μL，ddH2O 34.5 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）含MgCl20.5 μL，DNA模板2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。

表1 巴氏桿菌特異引物序列Table 1 The Pm primers

1.7 序列測定和進(jìn)化樹分析 陽性樣品送吉林庫美生物技術(shù)有限公司測序鑒定，結(jié)果與GenBank發(fā)表的多殺性巴氏桿菌進(jìn)行比對分析。搜索GenBank中已提交多殺性巴氏桿菌序列，應(yīng)用BioEdit軟件與樣品序列比較，MEGA5.0軟件繪制進(jìn)化樹進(jìn)行同源性分析。

1.8 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)參照國家檢驗(yàn)操作規(guī)程采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，又稱圓通平板法[10]。把經(jīng)過24 h純培養(yǎng)的分離到的巴氏桿菌培養(yǎng)物進(jìn)行10倍稀釋，并在鮮血瓊脂平板上進(jìn)行接種，按照0.2 mL對每個平板進(jìn)行接種，并涂抹均勻。在保持紙片間的適當(dāng)距離的基礎(chǔ)上，用經(jīng)過消毒后的無菌鑷子把各藥敏片按順序平鋪于培養(yǎng)基表面，放置于37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。藥物選擇參照呼倫貝爾市羊病常用藥物及文獻(xiàn)[11-13]，判定方法參照杭州微生物試劑有限公司藥敏紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)，觀察結(jié)果并測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 菌株形態(tài)特征和生長特性 病料革蘭氏染色鏡檢可見兩端鈍圓、兩極著色的陰性短桿菌；瑞士染色無鞭毛及芽孢，莢膜顯著。病料分離菌株在血平板上生長良好，呈清亮、淡灰白色、閃光的露珠狀，濕潤黏稠樣，菌落周圍不溶血。在普通LB瓊脂培養(yǎng)基上生長貧瘠，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長。

圖1 分離菌株血平板培養(yǎng)及革蘭氏、瑞氏染色結(jié)果Fig.1 Results of isolated bacterial Gram stain and Wright’s stain

2.2 雙重PCR鑒定結(jié)果 Pm種特異性基因KMT1引物擴(kuò)增出460 bp片段（圖A），用Pm 種特異性基因KMT1引物分別和A 群、B群、D群、E群、F群的莢膜血清型特異性基因引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，只有KMT1和D群引物擴(kuò)增出近460 bp和648 bp的2條特異性條帶，而KMT1和A群、KMT1和B群、KMT1和E群、KMT1和F群都只擴(kuò)增出1條460 bp的特異性條帶（圖B）。

圖2 培養(yǎng)Pm的PCR（A）以及血清型鑒定（B）結(jié)果Fig.2 Results of PCR(A) and serotype identification of isolated Pm

2.3 測序結(jié)果比對和遺傳進(jìn)化分析 本研究擴(kuò)增的特異性基因KMT1的序列與Genbank中巴氏桿菌印度株（登錄號：KY825087）同源性高達(dá)100%，與KX348143、KX449351、CP023305同源性高達(dá)99%，可以判斷分離培養(yǎng)菌為多殺性巴氏桿菌；擴(kuò)增的莢膜血清型特異性基因序列與GenBank中巴氏桿菌AF439804、AF302465、CP003313同源性高達(dá)99%，可以判斷分離培養(yǎng)菌為多殺性巴氏桿菌莢膜血清D群。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)如表2，分離菌株對青霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素耐藥，對諾氟沙星、卡那霉素、環(huán)丙沙星等藥物均不敏感。

3 討論

圖3 培養(yǎng)菌株KMT1基因遺傳進(jìn)化分析Fig.3 KMT1 gene phylogeny analysis of isolated strains

多殺性巴氏桿菌可以引起多種動物和人類疾病，是一種人畜共患病原。在國內(nèi)多殺性巴氏桿菌是引起綿羊及山羊呼吸道疾病的常見病原，由于廣泛存在于羊的各個生長階段，經(jīng)常導(dǎo)致羊生長性能降低甚至死亡，給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大損失，尤其近年來養(yǎng)羊業(yè)呈快速集約化發(fā)展，國內(nèi)外引種不斷加大，各地區(qū)羊只頻繁調(diào)動流通，巴氏桿菌病暴發(fā)也與日俱增。因此定期進(jìn)行預(yù)防接種，增強(qiáng)機(jī)體對該病的特異性免疫力才是防控巴氏桿菌病發(fā)生最有效最直接的方法，但由于多殺性巴氏桿菌存在A、B、D、E、F共5個莢膜血清群，各血清型之間大多無交叉免疫原性，某型菌株疫苗只對同型有較好的保護(hù)作用，致使在臨床上預(yù)防Pm的傳統(tǒng)疫苗效果不佳[14-15]，因此調(diào)查研究本地區(qū)流行的莢膜血清型、研制針對羊某型Pm的疫苗對防治羊呼吸道疾病，減少經(jīng)濟(jì)損失十分迫切。

本研究正是利用雙重PCR方法對Pm進(jìn)行莢膜血清型鑒定，通過結(jié)果分析表明2株羊源Pm均為莢膜血清D群。經(jīng)序列比對及遺傳進(jìn)化樹分析，EY1、EY2與印度分離株同源性高達(dá)100%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明分離菌株對氯霉素、氟氧沙星、哌拉西林等藥物敏感，對青霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素已耐藥，對諾氟沙星、卡那霉素、環(huán)丙沙星等藥物已不敏感。筆者通過走訪得知有關(guān)羊呼吸系統(tǒng)疾病的抗感染失敗的現(xiàn)象已屢見不鮮，多數(shù)病例對常用抗菌藥物表現(xiàn)抗性，呈反復(fù)發(fā)病，最終導(dǎo)致治療失敗，死亡率增加，這與羊場長期大劑量的使用抗生素治療不無關(guān)系。本研究臨床分離的D群Pm不僅為研制相應(yīng)的疫苗及科學(xué)防治巴氏桿菌病提供依據(jù)，同時對Pm疾病暴發(fā)的流行病學(xué)監(jiān)測和基因多樣性研究奠定了基礎(chǔ)。但限于收集的細(xì)菌株有限，有待對呼倫貝爾地區(qū)Pm進(jìn)一步監(jiān)測流調(diào)，找到本地區(qū)流行的莢膜血清型，為有效防控該地區(qū)羊巴氏桿菌病提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而提高養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。