趙宗平 ，朱順海 ，黃 兵 ，韓紅玉 ，趙其平 ，呂 凌 ,2，陳 婷 ，嚴(yán) 茗 ,2，董 輝

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

球蟲病是雞場中最普遍、造成損失最嚴(yán)重的疾病之一，并呈世界性分布[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年因球蟲病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20億英鎊[2]。目前，控制球蟲病主要依靠抗球蟲藥物和活疫苗的使用[3]，但由于球蟲耐藥性的產(chǎn)生，藥物殘留問題日益受到關(guān)注以及活疫苗潛在散毒等問題的產(chǎn)生，迫切需要尋找新的防治手段來控制球蟲病。雞球蟲的生活史包括細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育繁殖階段，其中子孢子是球蟲從體外入侵宿主細(xì)胞建立感染的第一個(gè)階段，而裂殖子是球蟲在宿主體內(nèi)入侵細(xì)胞繼續(xù)完成發(fā)育的關(guān)鍵階段。阻斷子孢子/裂殖子入侵宿主細(xì)胞，是防治球蟲病的一種有效方法。由此，分離鑒定與球蟲子孢子/裂殖子入侵宿主細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵分子，對研制新的抗球蟲藥物和疫苗均具有重要意義。

雞球蟲隸屬于頂器復(fù)合門，其子孢子/裂殖子都有一個(gè)由極環(huán)（poly ring）、棒狀體（rhoptry）、微線體（microneme）、類錐體（conoid）、致密顆粒（dense granules）、微孔(micropore)、膜下微管（subpellicular microtubute）等細(xì)胞器構(gòu)成的頂復(fù)體（apical complex），這些細(xì)胞器所分泌的蛋白在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中扮演了重要的角色。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對球蟲入侵宿主的機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，也鑒定出了一些與球蟲入侵相關(guān)的基因/蛋白，例如表面蛋白（surface antigens）、微線體蛋白、棒狀體蛋白和頂體膜抗原（apical membrane antigen）。但迄今，已有研究主要集中在蟲體入侵相關(guān)基因的研究，鮮有與子孢子入侵相關(guān)的宿主細(xì)胞蛋白的報(bào)道。

在前期實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)室利用iTRAQ技術(shù)研究了宿主細(xì)胞感染柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）子孢子后蛋白質(zhì)組學(xué)的變化，獲得了一批與子孢子入侵相關(guān)的宿主蛋白。本研究選取其中一個(gè)高表達(dá)蛋白—活化蛋白激酶C受體1（receptor for activated C kinase 1，RACK1）進(jìn)行克隆與表達(dá)，并研究其轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯水平在子孢子入侵后的變化以及其抗體對子孢子入侵能力的影響，為深入了解球蟲子孢子的入侵機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 柔嫩艾美耳球蟲（資源編號(hào)：CAAS2111 1611），pGEX-6P-1和pET28a載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物原蟲病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存；宿主菌TOP10、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker（DL2000）、2×Taq PCR Master Mix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、RNeasy? Mini Kit試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自QIAGEN公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶Sal I和EcoR I、SYBR? Premix Dimer EraserTM購自大連TaKaRa公司；鼠源GST標(biāo)簽抗體、RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶購自美國Promega公司；Cocktail 蛋白酶抑制劑、羊抗鼠IgGCy3二抗購自Sigma公司，GST·BindTMResin 購自Novagen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 cDNA模板的制備 取50 mg雞的新鮮肌肉組織剪碎，放進(jìn)2 mL EP管，加入Trizol，按照說明書步驟提取總RNA，取少量總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，利用紫外分光光度計(jì)測定濃度。符合要求后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。

1.2.2 pGEX-6P-1-RACK1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)已發(fā)表的RACK1的mRNA序列（GenBank登錄號(hào)：NM_001004378.2）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（片段大小為1002 bp）。上游引物：5'-GCGAATTCATGAC GGAGCAGATGACCCTC-5'，下游引物：5'-GCGT CGACCCTCATCTGGTTCCAATGGT-3'，上下游引物分別引入EcoR I、Sal I酶切位點(diǎn)（下劃線處）。以雞肌肉的cDNA為模板，進(jìn)行RACK1基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 變性30 s，58℃ 退火30 s，72℃延伸 2 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠回收目的片段。回收的基因片段和載體pGEX-6P-1質(zhì)粒分別經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后回收目的片段，用T4 DNA連接酶4℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TOP10中，并涂布于LB固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～12 h，挑取單克隆菌落培養(yǎng)，菌液經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 RACK1-GST重組蛋白的表達(dá)與純化 將測序正確的pGEX-6P-1-RACK1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。挑取單克隆菌落接種到LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.05 mmol/L，培養(yǎng)12 h后，4℃、10 000×g離心15 min，收集菌體沉淀，超聲裂解。裂解液于4℃、10 800×g 離心10 min，上清和沉淀經(jīng)SDSPAGE分析，確定上清中有目的蛋白的表達(dá)。使用GST·BindTMResin 對上清中的RACK1-GST目的蛋白進(jìn)行純化。

1.2.4 RACK1-GST純化蛋白的驗(yàn)證 取部分純化后的蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。全濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂乳4℃封閉過夜；PBST洗滌5次，加入鼠源GST標(biāo)簽一抗，37℃孵育2 h；PBST洗滌5次，加入1:10 000稀釋的熒光羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌4次，再經(jīng)PBS洗滌1次后，用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.5 重組蛋白R(shí)ACK1-GST多克隆抗體的制備 2月齡新西蘭大白兔每只皮下注射0.2 mg乳化的RACK1-GST重組蛋白（蛋白:弗氏完全佐劑=1:1）。之后隔2 w免疫注射0.2 mg與弗氏不完全佐劑1:1乳化的RACK1-GST重組蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫，此后每隔1 w加強(qiáng)免疫1次，免疫3次。終免7 d后收集分離血清。

1.2.6 子孢子的收集與純化 柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊按劑量為2.0×104個(gè)/只，接種14日齡無球蟲的雛雞，收集接種后6～8 d糞便中的卵囊[4]，在28℃的生化培養(yǎng)箱中通氧進(jìn)行孢子化。待卵囊孢子化率達(dá)到90%以上時(shí)，用飽和食鹽水漂浮法進(jìn)行純化。純化好的卵囊沉淀中加入少量PBS，混勻后加入含有玻璃珠的離心管中，漩渦震蕩3～5 min。鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量孢子囊釋放且卵囊破壁率達(dá)到95%以上時(shí)，960×g 離心8 min，沉淀用HBBS緩沖液重懸，轉(zhuǎn)移至三角形錐形瓶中，向其中加入0.5%的胰蛋白酶和5%的雞膽汁[5]，混勻后置于41℃水浴鍋中消化至95%以上的子孢子逸出，用砂芯漏斗過濾純化子孢子，收集濾液，離心。子孢子沉淀用PBS洗滌3次后，計(jì)數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞樣品的收集 復(fù)蘇液氮凍存的雞胚成纖維細(xì)胞（DF-1），在細(xì)胞狀態(tài)最好時(shí)消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。DF-1細(xì)胞（3×105個(gè)細(xì)胞/孔）接入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入完全培養(yǎng)基DMEM（10%胎牛血清+1%雙抗）37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)24 h。每孔接入6×105個(gè)新鮮的子孢子，置于41℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置未感染子孢子的DF-1細(xì)胞作為對照組，在接種后24 h、48 h、72 h，分別取出部分細(xì)胞樣品置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 子孢子感染對RACK1轉(zhuǎn)錄水平影響 收集不同感染時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞樣品，利用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA。用DNase I去除總RNA中的gDNA。參照RNeasy? Mini Kit說明書純化總RNA，用M -MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，用QIA quick? PCR 試劑盒純化cDNA, 純化產(chǎn)物按1:10稀釋作為RT-qPCR的模板。用 Primer Premier 5.0軟件對RACK1基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上游引物：5'-ACCTCACCACAGGAACCACCAC-3'，下游引物：5'-TGGCGGTTGTCGGAGGAGAAG-3'。以β-actin作為內(nèi)參基因，上游引物：5'-CACCACA GCCGAGAGAGAAAT-3'，下游引物：5'-TGACC ATCAGGGAGTTCATAGC-3'。用SYBR? Premix Dimer EraserTM試劑盒進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為（20 μL）：cDNA 1 μL、SYBRR Premix Dimer Eraser（2×）10 μL、ROX Reference DyeII 1 μL、無RNase水6 μL和10 mmol/L正向和反向引物各1 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s, 60℃退火30 s。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。將目的基因mRNA的Ct值進(jìn)行2-??Ct[??Ct=（Ct目的RNA-Ct內(nèi)參）處理組-（Ct目的RNA-Ct內(nèi)參）對照組）]轉(zhuǎn)換，表示處理組各樣本的表達(dá)量相對于對照組的倍數(shù)，之后運(yùn)用SPASS 21.0及GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.2.9 子孢子感染對RACK1蛋白翻譯水平影響 取不同感染時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，10 800×g 離心10 min；棄上清，沉淀中加入100 μL RIPA裂解液及1% cocktail蛋白酶抑制劑，置于冰上裂解30 min，輕輕地反復(fù)吹打裂解液，避免產(chǎn)生氣泡；4℃、10 800×g 離心15 min，吸取上清液即為細(xì)胞總蛋白，BCA法測定細(xì)胞總蛋白濃度，以內(nèi)參基因β-actin作為參照調(diào)整蛋白樣品上樣量，全濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂乳4℃封閉過夜；PBST洗滌5次，加入兔源RACK1多抗（1:100稀釋），37℃孵育2 h；PBST洗滌5次，加入1:10 000稀釋的熒光羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌4次，再經(jīng)PBS洗滌1次后，用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行圖片條帶灰度值分析。

1.2.10 RACK1抗體對子孢子入侵細(xì)胞能力的影響 參照碧云天ProteinA+G agarose說明書，對兔抗RACK1-GST多抗進(jìn)行純化。DF-1細(xì)胞（2×105個(gè)/孔）接入24孔細(xì)胞板，同時(shí)梯度加入純化的兔抗RACK1-GST多抗或正常IgG，使其終濃度為每孔100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL，與培養(yǎng)基共孵育細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。新鮮收集的子孢子經(jīng)CFDA SE細(xì)胞增殖與示蹤檢測試劑盒標(biāo)記[6]，以4×105個(gè)/孔加入細(xì)胞，于41℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。胰酶消化細(xì)胞收集細(xì)胞，PBS清洗，利用流式細(xì)胞儀檢測子孢子的入侵情況。同時(shí)設(shè)置無抗體孵育細(xì)胞的子孢子感染組作為對照組，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行入侵率統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 RACK1-GST重組蛋白的表達(dá)與純化 以雞肌肉的cDNA為模板，用所設(shè)計(jì)合成的特異性引物擴(kuò)增出1條目的條帶，大小為1002 bp，利用BLAST進(jìn)行序列同源比對，發(fā)現(xiàn)其與已知的RACK1同源性為99%，證明成功克隆該基因。RACK1編碼317個(gè)氨基酸，理論分子量為35 kDa。對表達(dá)重組蛋白菌液的沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在上清和沉淀中均有61 kDa目的蛋白存在，其中pGEX-6P-1載體約為26 kDa，RACK1蛋白約為35 kDa（圖1）。用GST-Bind柱對上清中的重組蛋白進(jìn)行純化，可獲得較純的RACK1-GST蛋白（圖1）。

圖1 RACK1-GST重組蛋白的表達(dá)與純化Fig.1 Expression and purification of recombinant protein RACK1-GST

2.2 RACK1-GST融合蛋白的Western blot分析 結(jié)果顯示，純化蛋白在61 kDa處有單一的目的條帶，證實(shí)所獲得的蛋白為RACK1-GST融合蛋白（圖2）。

2.3 子孢子感染對RACK1轉(zhuǎn)錄水平的影響 利用相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測子孢子感染細(xì)胞不同時(shí)間的RACK1的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子孢子入侵細(xì)胞后，RACK1的轉(zhuǎn)錄水平顯著性升高，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，感染后24 h的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于不感染組（P＜0.05），而48 h組和72 h組的轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著（P＞0.05），分別約為不感染組的14和16倍，均明顯高于24 h組（P＜0.05）（圖3）。

圖2 RACK1-GST融合蛋白的Western blot分析Fig.2 Western blot analysis of recombinant RACK1-GST protein

圖3 子孢子感染對RACK1轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.3 Effect of sporozoites infection on transcription level of RACK1

2.4 子孢子感染對RACK1蛋白翻譯水平的影響 結(jié)果表明，隨著子孢子感染細(xì)胞時(shí)間的增長，RACK1蛋白表達(dá)量不斷增加，24 h組顯著高于不感染組（P＜0.05），而48 h組和72 h組的蛋白表達(dá)水平差異不顯著（P＞0.05），均顯著高于24 h組和不感染對照組（P＜0.05）（圖4）。

2.5 兔抗RACK1-GST多抗對球蟲子孢子入侵細(xì)胞的影響 結(jié)果表明，無抗體孵育細(xì)胞對照組的子孢子入侵率為26%；正常IgG能抑制子孢子的入侵，但與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；100 μg/mL和200 μg/mL RACK1抗體作用細(xì)胞后對子孢子的入侵影響不大，入侵率與對照組和正常IgG組相比差異不顯著（P＞0.05），而300和400 μg/mL作用細(xì)胞能明顯促進(jìn)子孢子的入侵，入侵率顯著高于對照組和對應(yīng)濃度的正常IgG組（P＜0.05）。

圖4 子孢子感染對RACK1蛋白翻譯水平的影響Fig.4 Effect of sporozoites infection on protein translation level of RACK1

圖5 兔抗RACK1-GST多抗對子孢子入侵細(xì)胞的影響Fig.5 Effect of rabbit anti-RACK1-GST polyclonal antibody on sporozoites invading cell

3 討論

RACK1是G蛋白β亞基的同族體，由GNB2L1基因編碼，最早由Mochly-Rosen等[8]從大鼠腦組織的cDNA文庫中克隆出來，并稱其為一種全新活化的蛋白激酶C受體。已有研究表明，RACK1不僅可與細(xì)胞膜上活化的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）結(jié)合發(fā)生反應(yīng)，還能結(jié)合多種胞漿蛋白或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞內(nèi)多條代謝通路，發(fā)揮一系列的生理作用。根據(jù)其與配體蛋白結(jié)合后是否被釋放，可將其微觀作用分為以下2個(gè)方面：完成對特定蛋白結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)運(yùn)，如其能與cAMP特異性磷酸二酯酶PDE4D5結(jié)合參與cAMP途徑從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖以及調(diào)控所結(jié)合酶的活性，如RACK1能與整合素integrin β結(jié)合，通過細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架的通路對細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，繼而發(fā)揮其在局灶粘著復(fù)合物中的揮腳手架蛋白作用[9-11]；其還可以與受體蛋白酪氨酸磷脂酶PTPμ相結(jié)合調(diào)控以調(diào)控細(xì)胞間連接[12]。因此，RACK1在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝通路及生化反應(yīng)方面發(fā)揮著重要的作用。本文對雞源RACK1基因進(jìn)行克隆，并對其在球蟲子孢子感染細(xì)胞中的作用進(jìn)行了研究。

本實(shí)驗(yàn)克隆的雞RACK1片段大小為1002 bp，與已知的RACK1同源性為99%，編碼317個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量約為35 kDa。生物信息學(xué)分析顯示該編碼蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)，無信號(hào)肽。結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)該蛋白可能含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，4個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)，7個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，表明該蛋白的酶學(xué)活性可能受到其他蛋白的調(diào)節(jié)。利用NCBI的CDD程序?qū)υ摶蚓幋a的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示其具有WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域。將其克隆連接到表達(dá)載體pGEX-6P-1上，在大腸桿菌菌株中誘導(dǎo)獲得了高效表達(dá)的可溶性重組蛋白，經(jīng)GST柱純化獲得了較純的重組蛋白，對純化的蛋白以GST為一抗進(jìn)行Western blot鑒定，證實(shí)所獲得的蛋白為RACK1-GST融合蛋白。

為了研究RACK1在球蟲感染中的作用，我們選擇了雞胚成纖維細(xì)胞（DF-1）作為模型。柔嫩艾美耳球蟲寄生于雞盲腸，選擇DF-1細(xì)胞作為球蟲培養(yǎng)細(xì)胞，更貼近宿主。子孢子入侵DF-1后，24 h發(fā)育為滋養(yǎng)體，48 h為未成熟裂殖體，72 h為第1代成熟裂殖體[13]。本文對子孢子入侵DF-1細(xì)胞不同時(shí)間段的RACK1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯水平檢測發(fā)現(xiàn)，隨著子孢子感染時(shí)間的增加，二者均明顯增加。由此，表明子孢子的入侵會(huì)導(dǎo)致宿主RACK1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上調(diào)，且兩者的變化是同步的。為了探索RACK1對子孢子入侵的影響，我們選用了抗體與細(xì)胞共孵育的方法，結(jié)果表明兔抗rRACK1-GST多抗在低濃度孵育細(xì)胞的情況下對子孢子入侵宿主細(xì)胞影響不大，但在高濃度條件下能明顯促進(jìn)子孢子的入侵。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，推測RACK1蛋白可能在子孢子入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮了抑制作用。目前，未有RACK1蛋白對病原體感染細(xì)胞影響的報(bào)道，但發(fā)現(xiàn)有其他宿主蛋白對病原體感染影響的報(bào)道。李有文[14]研究了宿主核糖體蛋白L9對狂犬病毒生物學(xué)特性的影響，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)L9蛋白過表達(dá)能夠顯著抑制RABV的復(fù)制（10～20倍），干擾L9能夠顯著增強(qiáng)RABV復(fù)制（4～5倍），這些結(jié)果表明L9對RABV的復(fù)制具有重要的調(diào)節(jié)作用。張世偉[15]發(fā)現(xiàn)新城疫病毒感染DF-1細(xì)胞后，細(xì)胞的YB-1在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均出現(xiàn)上升趨勢，提示新城疫病毒可能通過某種途徑促進(jìn)YB-1的mRNA的轉(zhuǎn)錄，而YB-1可能參與抗病毒的過程，不利于新城疫病毒的翻譯和復(fù)制。說明宿主蛋白在病原體感染中發(fā)揮重要的作用。

本文對宿主RACK1蛋白在球蟲子孢子感染宿主中的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，子孢子入侵細(xì)胞后，細(xì)胞的RACK1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平均明顯提高，而抗體入侵抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的抗體可以明顯促進(jìn)球蟲子孢子的入侵能力，提示RACK1在子孢子入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮了抑制作用。而隨著子孢子在細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)發(fā)育成滋養(yǎng)體和裂殖體時(shí)，蟲體數(shù)量劇增，宿主細(xì)胞RACK1表達(dá)量進(jìn)一步升高以繼續(xù)與球蟲對抗。以上結(jié)果表明，RACK1是負(fù)調(diào)控球蟲入侵，但其具體機(jī)制還有待深入研究。