張向樂，朱紫祥，鄭海學(xué)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 口蹄疫國家參考實(shí)驗(yàn)室，蘭州730046）

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是一種烈性動物傳染病。FMD的病原為口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV），主要感染家畜豬、牛、羊和多種偶蹄類野生動物。患病動物主要癥狀為發(fā)熱，口腔、蹄部以及泌乳動物的乳頭和乳房周圍形成水泡[1,2]。FMD具有極強(qiáng)的傳染性，一旦發(fā)生，會迅速傳播，特別是在高密度飼養(yǎng)的畜群或沒有及時監(jiān)測的區(qū)域極易大面積流行。FMD的流行嚴(yán)重?cái)_亂畜牧生產(chǎn)，阻礙不同國家間動物及動物源性食品的正常貿(mào)易，對其防控也消耗大量的人力和物力[3,4]。FMDV為小RNA病毒科、口蹄疫病毒屬的成員，具有7種血清型，分別為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1。FMDV抗原高度變異，表現(xiàn)出抗原多樣性，不同血清型間無抗原交叉保護(hù)現(xiàn)象[5]。

FMDV是典型的免疫抑制性病毒，感染宿主后能夠引發(fā)顯著的免疫抑制，不僅影響疫苗的免疫效果，而且影響宿主對其他病原的抵抗能力[1]。宿主天然免疫系統(tǒng)在機(jī)體抵抗病原感染過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是機(jī)體抵抗外來病原入侵的第一道防線[6]。而FMDV能夠通過一系列機(jī)制抑制宿主天然免疫信號通路的激活，促進(jìn)自身復(fù)制，維持病毒對宿主的感染[7]。開展FMDV對天然免疫應(yīng)答調(diào)控的研究，有助于闡明FMDV的致病機(jī)制，為基因工程疫苗改造提供依據(jù)和思路。本文著重對FMDV抑制宿主天然免疫應(yīng)答的機(jī)制進(jìn)行闡述，希望能為FMD的防控提供參考。

1 口蹄疫病毒前導(dǎo)蛋白Lpro對天然免疫應(yīng)答的抑制

Lpro作為FMDV的水解酶，不僅直接參與病毒自身的復(fù)制，而且在免疫抑制過程中發(fā)揮著重要的作用。Lpro至少以三種機(jī)制來拮抗宿主的天然免疫應(yīng)答[8]，其中研究較早也較多的一類機(jī)制是 Lpro特異性切割真核宿主翻譯起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF）4GI和4GII，阻止了宿主細(xì)胞中加帽mRNA的募集[9]，從而抑制天然免疫下游抗病毒分子的合成和釋放。但在此過程中，病毒蛋白的合成并不受影響，仍能夠通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry sites，IRES）被翻譯出來[10,11]。另外兩種機(jī)制分別是病毒誘導(dǎo)的 NF-κB的特異性切割以及天然免疫信號分子的去泛素化。FMDV Lpro誘導(dǎo)p65/RelA（NF-κB的關(guān)鍵組分）降解，導(dǎo)致宿主細(xì)胞IFN-β轉(zhuǎn)錄的下調(diào)，從而抑制宿主天然免疫應(yīng)答[12,13]。但至今未發(fā)現(xiàn)p65/RelA具體的酶切位點(diǎn)以及酶切后的產(chǎn)物，所以Lpro對p65/RelA的降解機(jī)制仍不明確。對Lpro進(jìn)行序列分析以及生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)其具有去泛素化酶結(jié)構(gòu)功能域，且去泛素化功能位點(diǎn)（Cys51和His148）在FMDV的7種血清型中是高度保守的。Lpro與一種去泛素化酶USP14的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)非常相似。目前已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lpro具有去泛素化活性，可以顯著抑制視黃酸可誘導(dǎo)基因（ retinoic acid inducible gene I，RIG-I）、TANK-結(jié)合激酶1（TANK binding kinase I，TBK1）、TNF受體結(jié)合因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）和TRAF3這些天然免疫信號通路關(guān)鍵分子的泛素化，進(jìn)而抑制天然免疫應(yīng)答[13]。

2 口蹄疫病毒蛋白水解酶3Cpro對天然免疫應(yīng)答的抑制

3Cpro蛋白酶具有切割不同宿主蛋白的能力[14]，如3Cpro參與組蛋白H3的裂解，H3的氨基末端與真核細(xì)胞染色體轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)有關(guān)，3Cpro裂解H3改變了染色體的轉(zhuǎn)錄，最終使宿主細(xì)胞的翻譯受阻[15]。3Cpro同樣可以切割宿主eIF4A和eIF4G，抑制宿主抗病毒蛋白的合成，但其對eIF4A和eIF4G只能部分切割，并不能完全阻斷細(xì)胞的翻譯[16,17]。3Cpro能夠降解模式識別受體LGP2和RIG-I，促進(jìn)FMDV的復(fù)制[18,19]。3Cpro亦能降解天然免疫關(guān)鍵分子NEMO，影響NF-κB的入核，抑制下游抗病毒基因表達(dá)。3Cpro能夠降解入核因子KPNA1，阻斷STAT1的入核，抑制干擾素（interferon，IFN）的產(chǎn)生[20]。3Cpro還可以影響IRF3的磷酸化，阻礙IRF3的入核，進(jìn)而阻礙IRF3誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生。同時，3Cpro也能夠顯著抑制OAS2、ISG54、RANTES、IP-10和IFN-λ1等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而這些細(xì)胞因子對干擾素調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生和活性極為重要。JAK-STAT通路在天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，3Cpro可以阻斷JAKSTAT通路中關(guān)鍵分子STAT1/STAT2的入核，進(jìn)而抑制下游抗病毒基因的表達(dá)，抑制天然免疫反應(yīng)[21]。3Cpro還能夠通過溶酶體路徑降解雙鏈RNA依賴的蛋白激酶PKR。PKR是天然免疫通路中非常重要的抗病毒蛋白。3Cpro對PKR的降解并不依賴水解酶活性[22]。因此，3Cpro除了依靠蛋白水解酶活性發(fā)揮抑制天然免疫的功能，可能還通過其他方式發(fā)揮免疫抑制功能。

3 口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B對天然免疫應(yīng)答的抑制

FMDV 2B蛋白具有寡聚化形成跨膜孔道，增加宿主細(xì)胞膜通透性，擾亂宿主細(xì)胞Ca2+體內(nèi)平衡，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生自噬等特性[23,24]。研究同時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV 2B蛋白可以降解模式識別受體RIG-I和LGP2，抑制宿主抗病毒反應(yīng)，促進(jìn)FMDV復(fù)制。2B蛋白對RIG-I和LGP2介導(dǎo)的抗病毒作用的抑制是2B蛋白直接與RIG-I及LGP2結(jié)合而降低RIG-I與LGP2的蛋白水平，這種降低作用并不依賴于蛋白酶體、溶酶體或自噬路徑，其具體分子機(jī)制仍不清楚[18,19]。通過酵母雙雜交及免疫共沉淀方法發(fā)現(xiàn)FMDV 2B蛋白可以與宿主親環(huán)蛋白A（CypA）發(fā)生互作，而且在病毒感染狀態(tài)下，也證實(shí)了這種互作。CypA可以降解FMDV Lpro和3A蛋白，Lpro和3A蛋白能夠抑制天然免疫應(yīng)答，而2B蛋白與CypA的互作直接抑制了CypA對Lpro和3A蛋白的降解，進(jìn)而抑制宿主天然免疫應(yīng)答[25]。CypA還可以促進(jìn)RIG-I的泛素化從而促進(jìn)天然免疫發(fā)生[26]，而2B蛋白與CypA的互作是否影響RIG-I的泛素化修飾仍不清楚。

4 口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3A對天然免疫應(yīng)答的抑制

FMDV 3A蛋白與宿主嗜性及病毒毒力有關(guān)，與膜相關(guān)性及調(diào)控宿主蛋白的分泌有關(guān)聯(lián)[1,27]。3A蛋白還可以增強(qiáng)病毒3D聚合酶與病毒RNA的結(jié)合，促進(jìn)病毒的復(fù)制[28]。利用I型干擾素報告系統(tǒng)證實(shí)3A蛋白能夠抑制IFN-β信號通路活化，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)3A蛋白抑制天然免疫分子RIG-I、MDA5和VISA蛋白的表達(dá)，同時3A蛋白與RIG-I、MDA5和VISA蛋白有相互作用，抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體的形成。3A蛋白還抑制天然免疫接頭分子RIG-I、MDA5和VISA蛋白mRNA的表達(dá)水平[29]。因此3A蛋白可以通過多種機(jī)制抑制宿主天然免疫應(yīng)答，也同樣是FMDV感染過程中抑制天然免疫應(yīng)答的重要因子之一。

5 口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1對天然免疫應(yīng)答的抑制

VP1是FMDV最重要的抗原蛋白，能夠誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生[5]。VP1還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，促進(jìn)病毒的復(fù)制[30]。通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VP1可以與可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白（Sorcin）發(fā)生相互作用。Sorcin蛋白是天然免疫信號通路中的一個負(fù)調(diào)節(jié)因子。VP1可以與Sorcin結(jié)合，活化轉(zhuǎn)錄因子STAT3，STAT3的活化能夠抑制IKK的活化而抑制NF-κB通路的活化，進(jìn)而最終使得I型干擾素及部分細(xì)胞因子的表達(dá)受到抑制[31]。這表明VP1在FMDV感染過程中發(fā)揮著免疫抑制作用。

6 口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP3對天然免疫應(yīng)答的抑制

VP3作為FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒組裝過程中發(fā)揮著重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)VP3能夠抑制I型干擾素通路活化，還能夠抑制天然免疫接頭分子VISA蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步分析證實(shí)VP3抑制天然免疫接頭分子VISA蛋白mRNA的表達(dá)水平，而且VP3能夠與VISA蛋白發(fā)生相互作用，抑制VISA調(diào)控的復(fù)合體形成，進(jìn)而抑制IRF3二聚體化及其磷酸化，抑制IFN-β及干擾素誘導(dǎo)的抗病毒基因表達(dá)，促進(jìn)FMDV的復(fù)制[32]。JAK1在天然免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著非常重要的作用，VP3可以與宿主蛋白激酶JAK1蛋白發(fā)生相互作用抑制其表達(dá)，并通過溶酶體途徑降解JAK1蛋白，抑制JAK-STAT通路活化，減少干擾素誘導(dǎo)的抗病毒基因表達(dá)[33]。因此，VP3蛋白通過多階段阻斷的方式抑制宿主天然免疫應(yīng)答。

綜上所述，F(xiàn)MDV感染宿主細(xì)胞過程中，通過多種病毒蛋白，以多途徑阻斷的方式發(fā)揮免疫抑制作用，機(jī)制較為復(fù)雜（圖1）。目前一些問題仍尚未闡明，例如，已鑒定的具有免疫抑制功能的病毒蛋白間是否具有協(xié)同效應(yīng)？這些病毒蛋白的哪些功能域或關(guān)鍵位點(diǎn)參與了免疫抑制？除了已鑒定的蛋白和通路，是否還有其他蛋白或者通路也參與免疫抑制過程？總之，F(xiàn)MDV感染后，其多個病毒蛋白通過發(fā)揮天然免疫抑制功能，造成宿主免疫力低下，進(jìn)一步導(dǎo)致體液免疫應(yīng)答受到抑制，造成病毒的快速復(fù)制和持續(xù)感染，并增加了宿主感染其他病原體的風(fēng)險，使動物發(fā)生疾病的情況復(fù)雜化，給診斷和防控帶來一系列問題。深入闡明FMDV感染過程中的免疫抑制機(jī)制，將有助于制定相應(yīng)診斷方案和防控策略。

圖1 FMDV抑制宿主天然免疫應(yīng)答模式圖Fig.1 The schematic representation of immune suppression mechanism of FMDV