吳磊 居文政 戴國(guó)梁 陸超

摘 要 目的：建立大鼠血漿中大黃素、大黃酸和毛蕊異黃酮含量的測(cè)定方法，并研究大鼠體內(nèi)芪雪浸膏劑的藥動(dòng)學(xué)。方法：采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）法。色譜柱為Thermo C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫），流速為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 ?L，定量離子為大黃素質(zhì)荷比（m/z）269.7→226.1，大黃酸m/z 283.7→239.9，毛蕊異黃酮m/z 283.5→268.5，地西泮（內(nèi)標(biāo)物）m/z 285.0→154.1。6只大鼠灌胃芪雪浸膏劑8.91 g/kg（按臨床用量換算而得）后0.08、0.17、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12 h眼眶取血測(cè)定血藥濃度。采用DAS 1.0藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：大黃素、大黃酸和毛蕊異黃酮質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.988～198.8 ng/mL（r=0.998 8）、2～200 ng/mL（r=0.998 8）、2.092～209.2 ng/mL（r=0.998 5），精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn)的RSD均小于7.78%（n=5），基質(zhì)效應(yīng)分別為92.13%～102.23%、90.15%～93.67%、90.33%～104.63%（n=5），穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于6.54%（n=3）；3種成分在大鼠體內(nèi)的t1/2分別為（1.95±0.53）、（3.55±1.25）、（4.21±1.14） h，AUC0-12 h分別為（192.67±40.58）、（93.67±20.26）、（608.41±108.36） ?g·h/L，cmax分別為（89.56±12.87）、（31.84±10.58）、（300.56±50.57） ?g/L，tmax分別為（0.50±0.00）、（0.75±0.23）、（1.00±0.00） h，CL分別為（5.45±1.12）、（2.09±0.47）、（10.01±1.25） L/（h·kg）（n=6）。結(jié)論：建立的方法靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮在大鼠體內(nèi)的消除過(guò)程為一級(jí)消除，且符合二室開(kāi)放模型。

關(guān)鍵詞 芪雪浸膏劑；大黃素；大黃酸；毛蕊異黃酮；藥動(dòng)學(xué)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；大鼠

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）21-2935-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.13

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of emodin， rhein and calycosin in rat plasma， and to study pharmacokinetics of Qixue extract in rats. METHODS： LC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on Thermo C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid solution （gradient elution）， and flow rate of 0.2 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 20 ?L. The quantitative ions were emodin m/z 269.7→226.1， rhein m/z 283.7→239.9， calycosin m/z 283.5→268.5 and diazepam m/z 285.0→154.1. The blood concentration of samples from orbital cavity of 6 rats were determined 0.08， 0.17， 0.25， 0.5， 0.75， 1， 2， 4， 6， 8， 12 h after intragastric administration of Qixue extract 8.91 g/kg （by clinical dosage）. DAS 1.0 pharmacokinetic software was employed to calculate pharmacokinetic parameters. RESULTS： The linear ranges of emodin， rhein and calycosin were 1.988-198.8 ng/mL （r=0.998 8）， 2-200 ng/mL （r=0.998 8） and 2.092-209.2 ng/mL（r=0.998 5）， respectively. RSDs of precision and accuracy tests were all less than 7.78% （n=5）. The recoveries were 92.13%-102.23%， 90.15%-93.67% and 90.33%-104.63% （n=5）， respectively. RSDs of stability tests were all less than 6.54% （n=3）. The pharmacokinetic parameters of emodin， rhein and calycosin were as follows as t1/2 were （1.95±0.53）， （3.55±1.25）， （4.21±1.14） h； AUC0-12 h were （192.67±40.58）， （93.67±20.26）， （608.41±108.36） ?g·h/L； cmax were （89.56±12.87）， （31.84±10.58）， （300.56±50.57） ?g/L； tmax were （0.50±0.00），（0.75±0.23），（1.00±0.00） h； CL were （5.45±1.12）， （2.09±0.47）， （10.01±1.25） L/（h·kg） （n=6）， respectively. CONCLUSIONS： Established method is highly sensitive， accurate and reliable. The elimination process of emodin， rhein and calycosin are first-order elimination， which is in line with two-compartment model.

KEYWORDS Qixue extract； Emodin； Rhein； Calycosin； Pharmacokinetics； LC-MS/MS； Rats

芪雪浸膏劑由黃芪、六月雪、當(dāng)歸、虎杖、土茯苓、懷牛膝等共11味飲片組成，為江蘇省中醫(yī)院孫偉教授首創(chuàng)“益腎清利活血方”（后規(guī)范命名為“芪雪浸膏劑”），用以治療慢性腎臟病，具有清熱活血、清利除濕、祛風(fēng)通絡(luò)、益腎清利、和絡(luò)泄?jié)岬墓πВ粚?duì)代償期與失代償期的慢性腎功能衰竭患者具有穩(wěn)定其腎功能的作用；對(duì)腎功能衰竭期及尿毒癥晚期的患者可延緩其腎功能進(jìn)行性惡化的速度[1]。相關(guān)研究表明，該方可顯著地降低蛋白尿[2]，延緩慢性腎功能衰竭的進(jìn)展[3]，長(zhǎng)期堅(jiān)持治療可明顯改善患者的生活質(zhì)量[4]。目前針對(duì)該方的研究多集中在臨床應(yīng)用方面[5-7]，未見(jiàn)藥動(dòng)學(xué)特性方面的相關(guān)報(bào)道。在前期研究中，筆者考察了芪雪浸膏劑中大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮、大黃素甲醚、金絲桃苷、黃芪甲苷等共9種成分的含量測(cè)定方法，但在進(jìn)行體內(nèi)預(yù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，僅大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮這3種成分在大鼠血漿的含量較高。因此，本文建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）方法，考察了芪雪浸膏劑中大黃素、大黃酸和毛蕊異黃酮在大鼠體內(nèi)的血藥濃度和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，為芪雪方浸膏劑的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Fisher TSQ質(zhì)譜儀，包括電噴霧離子源、Xcalibar 1.4工作站（美國(guó)Thermo公司）；DionexU超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Dionexu公司）；BP-211D電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；AR 2140萬(wàn)分之一天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；VORTEX多功能渦旋混合器（美國(guó)Scientific公司）；5430R冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芪（批號(hào)：15020201）、六月雪（批號(hào)：15070602）、當(dāng)歸（批號(hào)：14120301）、虎杖（批號(hào)：15050701）、土茯苓（批號(hào)：15062704）、懷牛膝（批號(hào)：15022801）均購(gòu)自江蘇省醫(yī)藥有限公司；大黃素對(duì)照品（批號(hào)：140410，純度：>98%）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：140919，純度：>98%）、毛蕊異黃酮對(duì)照品（批號(hào)：140928，純度：>98%）均購(gòu)自南京寧岐醫(yī)藥科技有限公司；地西泮（內(nèi)標(biāo)物，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：171225-200903，純度：≥99%）；乙腈、甲醇均為色譜純；水為超純水。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，♂，6只，體質(zhì)量240～260 g，由南通大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK-（蘇）2014-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Thermo C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）梯度洗脫（0～1 min，25%A；1～5.5 min，25%→90%A；5.5～9 min，90%A；9～9.5 min，90%→25%A；9.5～13 min，25%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 ?L。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧（ESI）；檢測(cè)模式：正負(fù)離子切換模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；噴霧電壓：（+）4 000/（-）3 000 V；離子源溫度：200 ℃；毛細(xì)管溫度：270 ℃；鞘氣（N2）壓力：20 Arb；輔助氣（N2）壓力：5 Arb。定量離子為大黃素質(zhì)荷比（m/z）269.7→226.1，大黃酸m/z 283.7→239.9，毛蕊異黃酮m/z 283.5→268.5，地西泮m/z 285.0→154.1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮對(duì)照品適量，用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為0.994、56.8、1.046 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。取上述3種單一對(duì)照品貯備液適量，加甲醇配制成每1 mL含大黃素19.88 μg、大黃酸20 μg、毛蕊異黃酮20.92 μg的混合對(duì)照品溶液。以上溶液均保存于4 ℃冰箱。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 取地西泮對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋成502.5 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃保存，備用。

2.2.3 芪雪浸膏劑的制備 取黃芪、當(dāng)歸、六月雪、虎杖、土茯苓、懷牛膝等11味飲片適量，加入10倍量水，加熱回流提取2次，每次40 min，合并提取液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至稠膏狀，干燥，粉碎，過(guò)4號(hào)篩，即得浸膏粉末（每1 g原藥材相當(dāng)于0.6 g浸膏粉末，分別含大黃素31.17 μg、大黃酸23.16 μg、毛蕊異黃酮15.58 μg）。

2.3 血漿樣品處理

取血漿樣品100 ?L，加入甲醇400 ?L，渦旋振蕩5 min，離心（30 130×g，下同）5 min，取上清液于40 ℃真空揮干，再加入150 ?L甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩5 min，離心5 min，取上清液20 ?L，進(jìn)樣測(cè)定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取空白血漿（不加內(nèi)標(biāo)）、單一對(duì)照品溶液（加10 ?L內(nèi)標(biāo)）、灌胃給藥2 h后大鼠血漿（加10 ?L內(nèi)標(biāo)），按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮和地西泮互不干擾，峰形良好，且血漿中內(nèi)源性物質(zhì)也不干擾其測(cè)定，基線平穩(wěn)。樣品總離子圖見(jiàn)圖1。

2.4.2 線性關(guān)系與定量下限 取空白血漿100 ?L，分別加入大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮混合對(duì)照品溶液各10 ?L，配制成大黃素血漿質(zhì)量濃度為1.988、4.97、9.94、19.88、49.7、99.4、198.8 ng/mL，大黃酸血漿質(zhì)量濃度為2、5、10、20、50、100、200 ng/mL，毛蕊異黃酮血漿質(zhì)量濃度分別為2.092、5.23、10.46、20.92、52.3、104.6、209.2 ng/mL的模擬血漿樣品。按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，取20 ?L按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定。以各成分峰面積（y）對(duì)血漿質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得大黃素回歸方程為y=0.000 9x+0.003 3（r=0.998 8），線性范圍為1.988～198.8 ng/mL，定量下限為1.988 ng/mL；大黃酸回歸方程為y=0.000 7x+0.002 6（r=0.998 8），線性范圍為2～200 ng/mL，定量下限為2 ng/mL；毛蕊異黃酮回歸方程為y=0.001 8x-0.001 7（r=0.998 5），線性范圍為2.092～209.2 ng/mL，定量下限為 2.092 ng/mL。

2.4.3 精密度 取空白血漿100 ?L，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（大黃素：1.988、19.88、198.8 ng/mL；大黃酸：2、20、200 ng/mL；毛蕊異黃酮：2.092、20.92、209.2 ng/mL）的血漿質(zhì)控（QC）樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。每個(gè)質(zhì)量濃度同日內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，考察日內(nèi)精密度；另每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定3 d，考察日間精密度。結(jié)果，大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮日內(nèi)RSD分別為≤5.66%、≤4.71%、≤6.14%（n=5）；日間RSD分別為≤5.34%、≤5.07%、≤7.78%（n=3）。

2.4.4 準(zhǔn)確度 取空白血漿100 ?L，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備低、中、高不同質(zhì)量濃度的QC樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以大黃素、大黃酸和毛蕊異黃酮峰面積計(jì)算的相應(yīng)質(zhì)量濃度與真實(shí)質(zhì)量濃度的比值計(jì)算回收率。結(jié)果，大黃素、大黃酸和毛蕊異黃酮低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度樣品的回收率分別為大黃素78.50%、84.67%、89.33%，大黃酸81.43%、87.45%、94.82%，毛蕊異黃酮82.51%、83.05%、94.33%，RSD分別為4.22%～5.20%、2.78%～3.97%、2.17%～4.38%（n=5）。

2.4.5 基質(zhì)效應(yīng) 取離心管數(shù)只，分別精密加入10 ?L低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（大黃素質(zhì)量濃度為1.98、19.88、198.8 ng/mL，大黃酸質(zhì)量濃度為2、20、200 ng/mL，毛蕊異黃酮質(zhì)量濃度為2.092、20.92、209.2 ng/mL）混合對(duì)照品溶液，再加入10 ?L內(nèi)標(biāo)及80 ?L水，渦旋30 s，離心5 min，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積A。另按“2.3”項(xiàng)下方法制備空白血漿數(shù)管，揮干后同上操作，記錄峰面積B?；|(zhì)效應(yīng)公式為B/A×100%。結(jié)果，大黃素、大黃酸和毛蕊異黃酮血漿樣品低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度基質(zhì)效應(yīng)分別為大黃素95.26%、92.13%、102.23%，大黃酸93.67%、92.97%、90.15%，毛蕊異黃酮96.80%、90.33%、104.63%（n=5）。

2.4.6 樣品穩(wěn)定性考察 取空白血漿100 ?L，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備低、中、高3個(gè)不同質(zhì)量濃度的QC樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，分別在室溫（約25 ℃）下放置12 h、-20 ℃反復(fù)凍融3次、-80 ℃凍存10 d后進(jìn)行穩(wěn)定性考察，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定3份。結(jié)果，經(jīng)處理后的QC樣品室溫放置12 h后，大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮的峰面積的RSD均<6.49%（n=3），經(jīng)過(guò)-20 ℃反復(fù)凍融3次后峰面積的RSD均<6.54%（n=3），經(jīng)過(guò)-80 ℃凍存10 d后峰面積的RSD均<6.11%（n=3）。

2.5 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

取SD大鼠6只，給藥前12 h禁食不禁水，分別灌胃給予芪雪浸膏劑8.91 g/kg（按臨床用量換算而得），大鼠分別于給藥前及給藥后0.08、0.17、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12 h眼眶取血約0.3 mL，置于肝素化試管中，離心10 min，取上層血漿。按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定。利用回歸方程計(jì)算各峰面積對(duì)應(yīng)的血藥濃度，應(yīng)用DAS 1.0分析得出主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果，大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮在大鼠體內(nèi)的消除過(guò)程均屬一級(jí)消除，符合二室開(kāi)放模型。單劑量灌胃芪雪浸膏劑后大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮的藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

3 討論

芪雪浸膏劑是根據(jù)我院孫偉教授首創(chuàng)的“益腎清利活血方”制備而成，經(jīng)腎內(nèi)科50多年的臨床經(jīng)驗(yàn)積累、提煉，長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床，其相關(guān)的藥理作用報(bào)道較多[8-9]，但是方中潛在活性成分包括大黃素甲醚、大黃素、毛蕊異黃酮、大黃酸、槲皮素、楊梅素、虎杖苷、金絲桃苷、黃芪甲苷等在人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征尚不清楚[10-12]。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，筆者選擇大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮對(duì)芪雪浸膏劑在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行了初步考察。試驗(yàn)前考察了血漿樣品中待測(cè)成分的提取方法，比較了甲醇沉淀法、乙腈沉淀法、乙酸乙酯萃取法、正丁醇萃取法對(duì)回收率的影響[10，13]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇沉淀法回收率高，無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾，樣品峰形較好，故選擇甲醇沉淀法作為血漿前處理的方法。本試驗(yàn)選擇地西泮作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)[14]，其與待測(cè)物質(zhì)大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮保留時(shí)間適宜，峰形良好，無(wú)內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。試驗(yàn)建立了大鼠血漿中上述成分同步定量的LC-MS/MS法，結(jié)果表明，所建立的方法迅速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可以滿足生物樣本中的定量要求。

藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明，大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮均可被快速吸收入血，大鼠灌胃芪雪浸膏劑后5 min即可被檢測(cè)到，大黃素達(dá)峰時(shí)間在0.5 h左右，大黃酸達(dá)峰時(shí)間在0.75 h左右，毛蕊異黃酮達(dá)峰時(shí)間在1 h左右。灌胃8 h后大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮均表現(xiàn)為血藥濃度迅速降低，僅有少量被檢測(cè)到?？傮w而言，相比于毛蕊異黃酮，大黃素和大黃酸在大鼠血漿中的含量較少、持續(xù)時(shí)間較短。

本研究建立了LC-MS/MS法測(cè)定芪雪浸膏劑中大黃素、大黃酸、毛蕊異黃酮的含量，并對(duì)3種主要成分在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了考察，可為后續(xù)深入的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究提供參考。

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（收稿日期：2018-07-06 修回日期：2018-08-18）

（編輯：唐曉蓮）