侯玉華 袁龍 趙功寶 黃培池 楊慧 曹媛 張洪

摘 要 目的：建立同時測定肝康復水丸劑中沒食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA含量的方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法，以二極管陣列檢測器（DAD），色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測波長為267 nm（沒食子酸）、235 nm（梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷）、286 nm（丹酚酸B）、274 nm（丹皮酚）、270 nm（丹參酮ⅡA）；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。結(jié)果：沒食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚、丹參酮ⅡA檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為4.09～51.17 μg/mL（r=0.999 5）、8.35～104.35 μg/mL（r= 0.999 1）、7.78～97.25 μg/mL（r=0.999 9）、7.56～94.54 μg/mL（r=0.999 3）、16.70～208.80 μg/mL（r=0.999 5）、3.46～43.20 μg/mL（r=0.999 7）、23.13～289.10 μg/mL（r=0.999 9），檢測限分別為0.09、0.15、0.13、0.12、0.16、0.04、0.24 μg/mL，定量限分別為0.26、0.52、0.48、0.47、0.88、0.18、0.98 μg/mL，平均回收率分別為91.83%、96.11%、96.83%、95.82%、96.93%、93.95%、94.79%（n=6），精密度試驗的RSD均≤1.00%（n=6），供試品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定性試驗的RSD均≤0.96%（n=6），重復性試驗的RSD均≤0.99%（n=6）。結(jié)論：本方法準確、可靠，可用于肝康復水丸劑中上述7個成分的含量測定。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；二極管陣列檢測器；肝康復水丸劑；沒食子酸；梔子苷；芍藥內(nèi)酯苷；芍藥苷；丹酚酸B；丹皮酚；丹參酮ⅡA；含量測定

中圖分類號 R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）21-2907-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.07

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of the contents of gallic acid， jasminoidin， albiflorin， paeoniflorin， danshinolic acid B， paeonol and tanshinone ⅡA in Gankangfu water pill. METHODS： HPLC method with DAD was adopted. The determination was performed on Agilent ZORBAX SB-C18 column with mobile phase A consisted of acetonitrile and mobile phase B consisted of 0.1% phosphate solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were set at 267 nm （gallic acid）， 235 nm （jasminoidin， albiflorin， paeoniflorin）， 286 nm （danshinolic acid B）， 274 nm （paeonol） and 270 nm （tanshinone ⅡA） . The column temperature was set at 30 ℃ and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range of gallic acid， jasminoidin， albiflorin， paeoniflorin， danshinolic acid B， paeonol and tanshinone ⅡA were 4.09-51.17 μg/mL （r=0.999 5）， 8.35-104.35 μg/mL （r=0.999 1）， 7.78-97.25 μg/mL （r=0.999 9）， 7.56-94.54 μg/mL （r=0.999 3）， 16.70-208.80 μg/mL （r=0.999 5）， 3.46-43.20 μg/mL （r=0.999 7）， 23.13-289.10 μg/mL （r=0.999 9）， respectively. The detection limits were 0.09， 0.15， 0.13， 0.12， 0.16， 0.04 and 0.24 μg/mL； quantitative limits were 0.26， 0.52， 0.48， 0.47， 0.88， 0.18 and 0.98 μg/mL， respectively. The average recovery rates were 91.83%， 96.11%， 96.83%， 95.82%， 96.93%， 93.95% and 94.79%， respectively （n=6）. RSDs of precision test were not more than 1.00% （n=6）. RSDs of stability test were not more than 0.96% within 48 h （n=6）， and RSDs of repeatability test were than 0.99% （n=6）. CONCLUSIONS： The method is accurate and reliable， and can be used for content determination of above 7 components in Gankangfu water pill.

KEYWORDS HPLC； DAD； Gankangfu water pill； Gallic acid； Jasminoidin； Albiflorin； Paeoniflorin； Danshinolic acid B； Paeonol； Tanshinone ⅡA； Content determination

肝康復水丸劑（批準文號：蘇藥制字Z04001632，后文簡稱肝康復）屬于徐州中醫(yī)院自制丸劑，是由多種中藥經(jīng)提取、精制而成的純中藥復方制劑，臨床上主要用于病毒性肝炎的治療，其功效為疏肝理氣和健脾、胃[1]。肝康復由炒梔子、白芍、丹皮、丹參、柴胡、香附、當歸、白術(shù)、川樸、郁金、龍膽草、香附、甘草等多味中藥組成，其中白芍為君藥，其主要成分包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、丹皮酚、沒食子酸、苯甲酸；炒梔子為臣藥，其主要成分包括梔子苷、梔子新苷、熊果酸；丹參為佐藥，其主要成分包括丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ；丹皮為使藥，其主要成分包括芍藥苷、丹皮酚、沒食子酸。肝康復成分復雜，為了保證其藥品質(zhì)量，對多組分進行含量測定以控制藥品質(zhì)量尤其重要。

沒食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚、丹參酮ⅡA作為肝康復的主要活性成分，尚未見同時測定其含量的報道。本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）法，以二極管陣列檢測器（DAD）多波長變換同時測定肝康復中上述7個活性成分的含量，旨在為肝康復的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200 HPLC儀，包括G1312A四元梯度泵、G1329自動進樣儀、G1316柱溫箱、G1315D DAD、Agilent色譜工作站（美國Agilent公司）； XS105十萬分之一天平和EL104電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；As3120雙頻數(shù)控超聲波清洗儀（天津奧特賽斯儀器有限公司）；3K15高速冷凍離心機（美國Sigma公司）。

1.2 藥品與試劑

肝康復水丸劑（徐州市中醫(yī)院自制制劑，批號：151027、160323、170420、171222，規(guī)格：60 g/瓶）；沒食子酸對照品（批號：110831-201605，純度：90.8%）、梔子苷對照品（批號：110749-201316，純度：97.5%）、芍藥苷對照品（批號：110736-201640，純度：95.2%）、丹酚酸B對照品（批號：111562-201212，純度：95.4%）、丹皮酚對照品（批號：11708-201407，純度：99.9%）、丹參酮ⅡA對照品（批號：110766-201520，純度：98.9%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；芍藥內(nèi)酯苷對照品（上海安譜實驗科技股份有限公司，批號：76610010，純度：95.2%）；甲醇、乙腈為進口色譜純；水為屈臣氏純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 ?m）；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脫（0 min，2%A；0～10 min，5%A；10～20 min，10%A；20～30 min，15%A；30～40 min，20%A；40～50 min，30%A；50～60 min，80%A；60～80 min，80%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：267 nm（沒食子酸）、235 nm（梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷）、286 nm（丹酚酸B）、274 nm（丹皮酚）、270 nm丹參酮ⅡA；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液 分別精密稱取沒食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚、丹參酮ⅡA對照品適量，加70%甲醇溶液制成沒食子酸2.132 mg/mL、梔子苷0.434 8 mg/mL、芍藥內(nèi)酯苷0.810 4 mg/mL、芍藥苷1.131 mg/mL、丹酚酸B1.741 mg/mL、丹皮酚0.720 0 mg/mL、丹參酮ⅡA 0.803 mg/mL的溶液作為各對照品貯備液。

2.2.2 混合對照品溶液 分別精密移取“2.2.1”項下的7種對照品貯備液各適量，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇定容搖勻，稀釋成沒食子酸51.17 ?g/mL、梔子苷104.4 ?g/mL、芍藥內(nèi)酯苷97.25 ?g/mL、芍藥苷94.54 ?g/mL、丹酚酸B 208.8 ?g/mL、丹皮酚43.20 ?g/mL、丹參酮ⅡA 289.1 ?g/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取肝康復粉末（過30目篩）約1.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL后稱質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱質(zhì)量，用70%甲醇溶液補足減失質(zhì)量后，于12 000 r/min離心5 min，過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液 參照肝康復制備工藝和配方比例，分別制備缺白芍、丹皮陰性樣品、缺梔子陰性樣品、缺丹參陰性樣品，再按“2.2.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗

分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液（批號：170420）、陰性對照溶液各10 ?L，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結(jié)果顯示，該色譜條件下沒食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚、丹參酮ⅡA的色譜峰的峰形均較好，均能達到基線分離（分離度均大于1.5），拖尾因子在0.95～1.05之間，理論板數(shù)按梔子苷峰計不低于5 000。色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液0.4、0.5、1、2、3、4、5 mL，分別置于5 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋、定容至刻度，搖勻，即得上述線性混合對照品溶液。精密吸取上述溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸分析。回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）與線性范圍見表1。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.2.2”項下混合對照品溶液，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時得檢測限；當信噪比為10 ∶ 1得定量限。結(jié)果顯示，沒食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA的檢測限分別為0.09、0.15、0.13、0.12、0.16、0.04、0.24 μg/mL，定量限分別為0.26、0.52、0.48、0.47、0.88、0.18、0.98 μg/mL。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，沒食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為0.94%、0.63%、0.74%、1.00%、0.89%、0.52%和0.90%（n=6）。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一批供試品溶液（批號：170420），在室溫下放置0、4、8、12、24、48 h后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，沒食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為0.54%、0.72%、0.82%、0.62%、0.51%、0.40%和0.96%（n=6），表明供試品溶液在室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

取同一批肝康復（批號：170420）6份，分別按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算含量。結(jié)果顯示，沒食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA的平均含量分別為0.156 7、0.477 4、0.228 8、0.456 4、0.936 9、0.101 2、1.349 3 mg/g，RSD分別為0.99%、0.47%、0.80%、0.86%、0.49%、0.48%和0.45%（n=6），表明該方法重復性較好。

2.9 準確度試驗

精密稱取0.5 g已知含量（沒食子酸0.156 7 mg/g、梔子苷0.477 4 mg/g、芍藥內(nèi)酯苷0.228 8 mg/g、芍藥苷0.456 4 mg/g、丹酚酸B 0.936 9 mg/g、丹皮酚0.101 2 mg/g、丹參酮ⅡA 1.349 3 mg/g）的肝康復（批號：170420）6份，分別精密加入各對照品貯備液（沒食子酸0.04 mL、梔子苷0.6 mL、芍藥內(nèi)酯苷0.15 mL、芍藥苷0.18 mL、丹酚酸B 0.3 mL、丹皮酚0.7 mL和丹參酮ⅡA 0.9 mL），按“2.2.3”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2。

2.10 樣品含量測定

取3批肝復康各適量，按“2.2.3”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，記錄峰面積，計算沒食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 流動相選擇

在文獻[2-8]基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化色譜條件，分別考察了不同有機流動相（甲醇和乙腈）對結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，甲醇作為有機流動相，樣品組分分離不充分，尤其是沒食子酸與樣品其他組分不能分離，干擾較大，所以選擇乙腈為有機流動相。選擇水相時，首先考慮了純水、磷酸、磷酸鹽緩沖液，結(jié)果顯示，0.1%磷酸溶液可顯著提高各組分峰形對稱性及分離度，經(jīng)大量試驗確定本文的最優(yōu)流動相、梯度洗脫方案。

3.2 檢測波長選擇

筆者前期試驗采用DAD在200～400 nm范圍內(nèi)對沒食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA 7個成分進行光譜掃描，結(jié)果顯示，其最大吸收波長分別為215/260、238、230、230、203/286、212/274、224/270 nm。考慮樣品溶劑含有甲醇，甲醇在215、203、212、224 nm波長處有部分紫外吸收會帶來定量誤差，所以沒有選擇215、203、212、224 nm作為紫外檢測波長。再則筆者發(fā)現(xiàn)沒食子酸在260 nm波長處樣品基線不穩(wěn)且色譜峰峰形對稱性不好，故參考文獻[9]選擇了267 nm波長作為沒食子酸的紫外檢測波長，以滿足定量分析要求。梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷分別在238、230、230 nm波長處各有最大吸收，但因這3個成分保留時間相差太近，波長切換太頻繁，故選擇235 nm波長作為這3個成分的紫外檢測波長，且此波長對3個成分的含量測定無影響。其余3個成分丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA的紫外檢測波長分別為286、274、270 nm?？紤]到7個成分的紫外吸收波長相差過大，故本試驗采用梯度洗脫波長切換實現(xiàn)7個成分的含量同時測定。

3.3 樣品提取條件選擇

樣品處理首先參考了2015年版《中國藥典》的處理方法[10]，但此制劑中丹皮酚含量濃度特別少，丹參酮ⅡA成分含量較高，不能滿足定量分析要求。本試驗用水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇、50%乙醇、70%乙醇和中性乙醇作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用70%甲醇溶液提取效率高。同時考察提取方式（超聲和加熱回流），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲提取與回流提取效率沒有顯著差別，其中超聲提取較簡便、快捷。另外對比了超聲時間15、30、40 min及提取溶劑用量，最終選擇超聲提取樣品粉末1.0 g，提取溶劑70%甲醇50 mL超聲30 min，作為供試品的提取方法。

當前隨著儀器檢測手段的不斷發(fā)展，中藥制劑質(zhì)量標準由單一有效成分向多組分體系發(fā)展[11]。本試驗建立了同時測定肝康復中沒食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA 7個成分含量的方法，結(jié)果顯示，該法具有簡便、準確、重現(xiàn)性好、靈敏度高的特點，為肝康復質(zhì)量控制和質(zhì)量標準的建立提供了參考方法和依據(jù)。

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（收稿日期：2018-06-23 修回日期：2018-08-30）

（編輯：鄒麗娟）