吳勇亮 苗鵬飛 于輝 譚淑雯 楊虹 彭鐘琴 楊映

摘要：【目的】明確鱖魚發(fā)病死亡的原因，并進(jìn)行病原菌分離鑒定及藥敏特性分析，為生產(chǎn)養(yǎng)殖中有效防治遲緩愛德華菌病提供參考依據(jù)?！痉椒ā繌幕疾△Z魚肝臟中分離優(yōu)勢(shì)菌株，采用回歸感染試驗(yàn)確定其致病性，通過細(xì)菌生理生化及16S rDNA序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，并以K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)?！窘Y(jié)果】分離出的菌株FS170808具有一定致病力，可使健康鱖魚發(fā)病死亡，其半致死劑量為9.5×105 CFU/mL；菌株FS170808經(jīng)生理生化和16S rDNA序列分析鑒定均為遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda），其對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、頭孢呋辛、慶大霉素、卡那霉素、氧氟沙星、四環(huán)素和多西環(huán)素等17種藥物高度敏感，對(duì)頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢他啶、新霉素和多粘菌素B中度敏感，對(duì)苯唑西林、復(fù)方新諾明、麥迪霉素和萬古霉素已產(chǎn)生耐藥性?！窘Y(jié)論】遲緩愛德華氏菌可引起鱖魚發(fā)病死亡，生產(chǎn)養(yǎng)殖中可選用氨芐西林、頭孢曲松、頭孢呋辛和慶大霉素等高度敏感性藥物進(jìn)行防治。

關(guān)鍵詞： 鱖魚；遲緩愛德華氏菌；分離鑒定；16S rDNA；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S965.199 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）04-0794-06

Isolation，identification and drug susceptibility test of pathogenic Edwardsiella tarda in Siniperca chuatsi

WU Yong-liang， MIAO Peng-fei， YU Hui， TAN Shu-wen， YANG Hong，

PENG Zhong-qin， YANG Ying*

（College of Life Science and Engineering， Foshan University， Foshan， Guangdong 528225， China）

Abstract：【Objective】Death causes of Siniperca chuatsi were studied， isolation and identification of pathogenic bacteria and analysis of drug susceptibility were conducted to provide reference for effective prevention and treatment to Edwardsiella tarda disease in aquaculture. 【Method】Dominant strain was isolated from liver tissue of ill S. chuatsi. Pathogenicity of the strain was determined by recursive infection experiment. The strain was identified by using bacteria physiological and biochemical analysis and 16S rDNA sequence analysis. K-B paper disk diffusion was applied to test its drug susceptibility. 【Result】Isolated strain FS170808 had certain pathogenicity and could lead to morbidity and death of healthy S. chuatsi. Its median lethal dose was 9.5×105 CFU/mL. The strain FS170808 was identified as E. tarda through physiological and biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis. The strain was highly susceptible to 17 kinds of drugs including ampicillin， cefatriaxone， cefuroxime， gentamicin， kanamycin， ofloxacin， tetracycline， doxycycline and the others， intermediately susceptible to cephalexin， cefradine， ceftazidine， neomycin， polymyxin B， and resistant to oxacillin， selectrin， aboren， and vancomycin. 【Conclusion】E. tarda can lead to the morbidity and death of S. chuatsi. The highly susceptible drugs such as ampicillin， cefatriaxone， cefuroxime and gentamicin can be used for prevention and treatment in aquaculture.

Key words： Siniperca chuatsi； Edwarsdsiella tarda； isolation and identification； 16S rDNA； drug susceptibility test

0 引言

【研究意義】遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）為腸桿菌科愛德華菌屬的革蘭氏陰性短桿菌，廣泛存在于溪水、湖泊和海洋等水環(huán)境中，能感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類甚至哺乳類動(dòng)物（Wang et al.，2014；Su et al.，2015），因具有兼性胞內(nèi)寄生特性，成為人—魚—獸共患病的條件致病菌。近年來，遲緩愛德華氏菌對(duì)魚類健康的危害越來越凸顯（Xu and Zhang，2014），可使魚類腹部積水腫脹、體表出血、腸內(nèi)出現(xiàn)黏液等，并造成大量死亡。因此，加快遲緩愛德華氏菌的鑒定及藥物敏感性檢測(cè)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】遲緩愛德華氏菌、鮰愛德華氏菌（E. ictaluri）和保科愛德華氏菌（E. hoshinae）均為愛德華氏菌屬細(xì)菌，其中遲緩愛德華氏菌的寄主范圍最廣，可感染多種魚類（Leung et al.，2012）。陳言峰等（2017）采用16S rDNA基因測(cè)序、進(jìn)化樹構(gòu)建和細(xì)菌生化管檢測(cè)等方法對(duì)鯪魚源致病菌進(jìn)行鑒定，并采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離獲得的致病菌株為遲緩愛德華氏菌；程俊茗等（2017）采用管家基因測(cè)序、進(jìn)化樹構(gòu)建和菌株生理生化檢測(cè)等方法對(duì)分離的鯽源菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌株為遲緩愛德華氏菌。此外，研究者們?cè)诎唏R魚（Barchydanio rerio var）（Wang et al.，2014）、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictnlurus punctatus）、鯉魚（Cyprinus carpio）、日本鰻鱺（Anguilla japonica）、尼羅羅非魚（Oreochromis nilo-tica）、漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigmo）（孫莉娜，2016）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）（Huo et al.，2017）中也發(fā)現(xiàn)有遲緩愛德華氏菌感染?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鱖魚（Siniperca chuatsi）因肉嫩味美、營(yíng)養(yǎng)豐富而廣受消費(fèi)者喜愛，市場(chǎng)需求量大，經(jīng)濟(jì)前景良好。隨著鱖魚養(yǎng)殖密度不斷提高、病害逐年增加，對(duì)鱖魚的病害防治技術(shù)研究越顯急迫（黃嘉榮，2016），但至今未見鱖魚感染遲緩愛德華氏菌的相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)患病鱖魚的肝臟進(jìn)行病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，確定鱖魚發(fā)病原因并提供用藥指導(dǎo)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中防治遲緩愛德華菌病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

鱖魚病樣采自廣東佛山市南海區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)，體重240～260 g/尾。健康鱖魚（248±18 g/尾）取自佛山市南海百容水產(chǎn)良種有限公司。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基和細(xì)菌微量生化鑒定管均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，抗生素紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1. 2 病原菌分離與純化

在無菌狀態(tài)下，從患病瀕死鱖魚的肝臟、腎臟和脾臟中取樣，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h后從肝臟中分離出優(yōu)勢(shì)菌落并進(jìn)行純培養(yǎng)，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，命名為FS170808；28 ℃培養(yǎng)24 h后，加入無菌甘油，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 人工感染試驗(yàn)

健康鱖魚暫養(yǎng)1周，水溫控制在28 ℃，連續(xù)充氣增氧，無異常情況后進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。70尾健康鱖魚分為7組（6組為試驗(yàn)組，1組為對(duì)照組），每組10尾。將菌株FS170808稀釋成1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104和1.5×103 CFU/mL 6個(gè)濃度，每個(gè)濃度按0.3 mL/尾的劑量對(duì)鱖魚進(jìn)行腹腔注射；對(duì)照組鱖魚則按相同劑量在相同部位注射生理鹽水。連續(xù)觀察15 d，每天正常喂養(yǎng)、充氧、吸污換水，同時(shí)觀察記錄發(fā)病癥狀及死亡情況，對(duì)患病鱖魚進(jìn)行病原菌分離鑒定，并根據(jù)寇氏法（李翠萍等，2012）計(jì)算半致死劑量。

1. 4 病原菌生理生化鑒定

對(duì)菌株FS170808進(jìn)行革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察；同時(shí)接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征。將菌株FS170808接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h后分別取80.0 μL菌液加入到葡萄糖（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）、葡萄糖磷酸鹽胨水（V-P）、葡萄糖磷酸鹽胨水（M.R.）、蔗糖、甘露醇、乳糖、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、西蒙氏檸檬酸鹽、硫化氫、尿素和麥芽糖的微量生化鑒定管中，37 ℃培養(yǎng)12～48 h后判定結(jié)果。

1. 5 病原菌16S rDNA基因序列鑒定及發(fā)育樹構(gòu)建

菌株FS170808接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)、DNA提取、16S rDNA序列PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物測(cè)序等試驗(yàn)操作步驟均參照馮藝等（2017）的方法。將測(cè)序得到菌株FS170808的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）進(jìn)行BLAST比對(duì)，同時(shí)利用MEGA 4.1的ClustalX 1.83進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，再用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 6 藥敏試驗(yàn)

以無菌生理鹽水將菌株FS170808的24 h培養(yǎng)物制成1.5×108 CFU/mL的菌懸液，取80.0 μL菌懸液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，采用K-B紙片擴(kuò)散法，用無菌鑷子將抗生素紙片輕輕貼在瓊脂培養(yǎng)基表面，28 ℃培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（Walker，1999）分析數(shù)據(jù)，從而判定菌株FS170808對(duì)26種抗生素的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 自然發(fā)病鱖魚的主要癥狀及病原菌的形態(tài)特征

患病鱖魚腹部發(fā)紅、肛門紅腫。剖檢可見肝臟充血，腹腔有血樣腹水，腸壁充血嚴(yán)重（圖1）。從肝臟分離獲得的優(yōu)勢(shì)菌株FS170808為革蘭氏陰性短桿菌，能運(yùn)動(dòng)；在SS瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其菌落中央有黑色小點(diǎn)；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h后，長(zhǎng)出邊緣整齊、凸起、正圓形、灰白色、濕潤(rùn)、直徑約0.48 mm的菌落（圖2）。

2. 2 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)人工感染發(fā)病鱖魚的主要臨床癥狀與自然感染菌株FS170808的鱖魚癥狀相似，其腹部出血，肛門充血、外突。從死亡鱖魚的肝臟中可再次分離到原感染菌株，說明菌株FS170808是引起鱖魚發(fā)病死亡的病原菌。注射無菌生理鹽水的對(duì)照組鱖魚無死亡現(xiàn)象，外觀特征無明顯變化，剖檢也未發(fā)現(xiàn)任何病理變化。根據(jù)寇氏法的計(jì)算法則計(jì)算可知菌株FS170808對(duì)鱖魚的半致死劑量為9.5×105 CFU/mL（表1）。

2. 3 病原菌的生理生化特征

對(duì)菌株FS170808進(jìn)行生理生化檢測(cè)，并參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行判斷，發(fā)現(xiàn)菌株FS170808與遲緩愛德華氏菌的表型特征基本一致，表現(xiàn)為能利用葡萄糖、麥芽糖和賴氨酸，可產(chǎn)生硫化氫，M.R.試驗(yàn)呈陽(yáng)性（表2）。

2. 4 16S rDNA基因序列分析結(jié)果

通過PCR擴(kuò)增獲得菌株FS170808的16S rDNA基因片段為1407 bp。NCBI同源性分析結(jié)果表明，菌株FS170808與遲緩愛德華氏菌的同源性高達(dá)99%?；?6S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也發(fā)現(xiàn)菌株FS170808與遲緩愛德華氏菌聚為一個(gè)分支（圖3），綜合生理生化檢測(cè)結(jié)果和16S rDNA基因序列分析結(jié)果，確定菌株FS170808為遲緩愛德華氏菌。

2. 5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，菌株FS170808對(duì)喹諾酮類的諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星，林可酰胺類的克林霉素，四環(huán)素類的四環(huán)素、米諾環(huán)素、多西環(huán)素，氨基糖苷類的丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素，β-內(nèi)酰胺類的頭孢哌酮、氨芐西林、羧芐西林、哌拉西林、頭孢曲松、頭孢唑林、頭孢呋辛等高度敏感；對(duì)部分β-內(nèi)酰胺類如頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢他啶，氨基糖苷類的新霉素和多粘霉素類的多粘菌素B中度敏感；而對(duì)于磺胺類的復(fù)方新諾明、β-內(nèi)酰胺類的苯唑西林、大環(huán)內(nèi)酯類的麥迪霉素和多肽類的萬古霉素已產(chǎn)生耐藥性。

3 討論

遲緩愛德華氏菌可分為野生型和生物型兩類（邵建春，2016）。生物型遲緩愛德華氏菌能利用乳糖、蔗糖、甘露醇等糖類作為能源，不產(chǎn)生硫化氫氣體，至今僅在水體和蛇中發(fā)現(xiàn)，尚無感染致病的報(bào)道（王波和莫照蘭，2007）；而野生型遲緩愛德華氏菌與上述的生化指標(biāo)恰好相反，且較常見。由于菌株FS170808不能利用乳糖、蔗糖、甘露醇作為能源，可產(chǎn)生硫化氫氣體，故判定菌株FS170808為野生型遲緩愛德華氏菌。

魚類遲緩愛德華菌病具有流行范圍廣、發(fā)病率和病死率高等特點(diǎn)（鄭大海和麥康森，2004），其致病菌遲緩愛德華氏菌于1962年被Hoshina首次報(bào)道，目前已有20多種魚類可感染遲緩愛德華氏菌并致??；該病菌還可感染人類，引起腸胃炎、流行性腹瀉、腦膜炎或敗血癥等病癥（程俊茗等，2017）。遲緩愛德華氏菌主要通過皮膚病灶或腸道進(jìn)入魚體內(nèi)，并在肝臟或腎臟中生長(zhǎng)增殖（靳仁娉，2012），致病過程一般分為黏附、侵入、抵抗宿主免疫反應(yīng)、生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)生毒素和酶等階段。黏附的主要場(chǎng)所是鰓、胃腸上皮細(xì)胞和體表，可通過多種黏附素如血凝素、菌毛蛋白對(duì)宿主細(xì)胞表面進(jìn)行黏附作用（Ling et al.，2001；Sakai et al.，2003），一旦進(jìn)入組織或細(xì)胞中，菌體會(huì)借助Ⅲ型和IV型分泌系統(tǒng)來抵抗宿主的殺菌機(jī)制（Tan et al.，2005），期間會(huì)分泌一系列胞外酶如膠原酶、蛋白酶、軟骨素和溶血素等協(xié)助菌體擴(kuò)散至全身，從而使魚體發(fā)生纖維素性化膿性炎癥，病灶隨后轉(zhuǎn)移至其他器官，最后因敗血癥而導(dǎo)致死亡（Leung et al.，2012；Park et al.，2012）。

盡管免疫學(xué)治療、生物防治（Patil et al.，2001；郭玉娟和陳學(xué)年，2006；陳樹河等，2016）等新防治疾病手段相繼出現(xiàn)，但由于養(yǎng)殖條件、經(jīng)濟(jì)效益、養(yǎng)殖戶素質(zhì)等的限制，抗生素治療仍是細(xì)菌性疾病的主要治療手段。本研究中，分離獲得的鱖魚源遲緩愛德華氏菌對(duì)新霉素具有中度敏感性，對(duì)復(fù)方新諾明、萬古霉素等已產(chǎn)生耐藥性。而前人的相關(guān)研究指出，寶石魚（JadePerch）源遲緩愛德華氏菌對(duì)萬古霉素中度敏感（葉旭紅等，2010）、雜交鱧（Channa ma-culata ♀×C. argus ♂）源野生型遲緩愛德華氏菌對(duì)新霉素高度敏感（陳言峰等，2014）、黃鱔源遲緩愛德華氏菌對(duì)復(fù)方新諾明高度敏感（邵建春，2016）?？梢?，不同來源的遲緩愛德華氏菌對(duì)藥物敏感性具有明顯差異，可能與寄主本身及養(yǎng)殖過程中的用藥差異相關(guān)。

4 結(jié)論

遲緩愛德華氏菌可引起鱖魚發(fā)病死亡，生產(chǎn)養(yǎng)殖中可選用氨芐西林、頭孢曲松、頭孢呋辛、慶大霉素等高度敏感性藥物進(jìn)行防治。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）