李國強 李巖

摘要目的：研究匍匐大戟醇的提物在腫瘤的對抗作用以及在血管新生的抑制作用方法取正常的細胞和腫瘤細胞，用藥之后通過MTT的方法來對IC50進行檢測。原代對大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞（RAECs）進行培養(yǎng)，進行細胞的分析實驗，用的是體外iCELLigence的方法，此外，還進行了細胞遷移法和細胞管組實驗的實驗方法，研究了匍匐大戟提取物對RAECs的增量、遷移和城市管理的影響，同時對pAkt，Akt，peNOS，eNOS，TGFβ1，Smad3等血管新生相關(guān)信號通路蛋白的表達情況進行檢測，檢測的方法是Western blot技術(shù)。通過對人肝癌裸鼠移植瘤模型的建立，予以匍匐大戟醇提物，裸鼠體重、腫瘤大小、腫瘤等質(zhì)量檢測，同時對每組裸鼠血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血小板源性生長因子（PDGFBB）水平進行檢測，檢測的方法是LISA技術(shù)方法，同時還要對移植瘤組織的形態(tài)進行觀察，移植瘤組織是進行過HE染色的。結(jié)果：匍匐大戟的提純物對小鼠的最大的耐受量MTD是9429/（g·kg）。對于大鼠成肌細胞（L6細胞株），匍匐大戟醇提物沒有明顯的抑制作用，而對于對鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株P(guān)C12、人肝癌細胞HepG2、大、人非小細胞肺癌細胞株A549、人宮頸癌細胞細胞株Hela來講，匍匐大戟有明顯的抑制作用，此外匍匐大戟醇提物能夠增加RAECs的值、遷移和試管的形成，也會有顯著的抑制作用。結(jié)論：匍匐大戟醇提物能夠?qū)δ[瘤的生長和血管的生成具有很顯著的抑制作用，這種情況也是匍匐大戟發(fā)揮抗腫瘤作用的有效機制之一。

關(guān)鍵詞匍匐大戟；腫瘤；血管新生

Antitumor and Inhibitory Effect of Ethanol Extract from Euphorbia Prostrate

Li Guojiang1，Li Yan2

（1 Cancer surgery in Xinyang Central Hospital of Henan，Xinyang 464000，China； 2 Xinwen Mining

Central Hospital of Refco Group Ltd，Xintai 271233，China）

AbstractObjective：To explore the antagonism of ethanol extract from Euphorbia stolondi in tumor and its inhibitory effect on angiogenesis. Methods：Normal cells and tumor cells were cultured， and IC50 was detected by MTT after medication. The primary rat thoracic aorta endothelial cells （RAECs） were cultured and analyzed by iCELLigence method. The effects of Euphorbia extract on the increment， migration and vascularization of RAECs were studied by cell migration method and cell tube group. Western blot technology was used to detect the expression of pAkt，Akt，peNOS，eNOS，TGFβ1，Smad3 and other proteins related with angiogenesis signaling pathways. When the model of human liver cancer established with nude mice carried transplanted tumor after intervened by prostrate Euphorbia alcohol extract， the body weight， tumor size and tumor quality of nude mice were detected， and the levels of vascular endothelial growth factor （VEGF） and platelet derived growth factor （PDGFBB） in the serum of nude mice were detected by LISA technique. At the same time， the morphology of transplanted tumor ，which is stainined by HE， is observed. Results：The maximum MTD tolerance of the extract from Euphorbia stolon was 94.29g·kg1. For the rat myoblasts （L6 cell lines）， the prostrate alcohol extract has no obvious inhibitory effect， while the prostrate Euphorbia has convincing inhibitory effect on the rat adrenal pheochromocytoma cell line PC12， human hepatoma cell HepG2， human nonsmall cell lung cancer cell line A549 and human cervical cancer cell Hela. In addition， ethanol extract of Euphorbia stolon can increase the RAECs value， migration and vascularization， and also have a significant inhibitory effect. Conclusion：The prostrate alcohol extract can significantly inhibit the growth of tumor and the formation of blood vessels， which may be one of the effective mechanisms of the antitumor effect of the Euphorbia prostrate.

Key WordsEuphorbia prostrate； Tumor； Angiogenesis

中圖分類號：R2855文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.054

大戟屬植物具有豐富的抗癌活性成分，如一年生草本、草藥等，但僅能抵抗藥理學(xué)、驅(qū)蟲劑、腹瀉等的炎性反應(yīng)，沒有報道報道過大戟屬植物有抗腫瘤的活性。然而，在腫瘤轉(zhuǎn)移和增加的過程中，會發(fā)生血管生成。都知道，新生血管的形成則是依賴于內(nèi)皮細胞的增值、遷移和成管的過程當(dāng)中。與此同時也會有很多的信號的通路在血管新生過程中參與調(diào)控的重任。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明，在控制腫瘤血管的生成方面，有一定的控制作用，此方法在抗腫瘤方面很有效，在對抗腫瘤血管生成的研究熱門中，大戟屬植物已經(jīng)成為研究的最佳藥物。通過本文的初步研究，采用的是體內(nèi)和體外的試驗方法，探討了在體外實驗中對匍匐大戟醇提物抗腫瘤血管生成的作用，對匍匐大戟醇提物的藥用價值做了進一步的研究，并在今后的醫(yī)學(xué)研究中奠定了基礎(chǔ)。

1材料

以昆明種小鼠作為此次的研究對象，雌雄數(shù)量均為總數(shù)量的一半，體重在18～22 g之間，是昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心和重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供的試驗小鼠。此次研究用肝癌細胞系（HepG 2）、非小細胞肺癌細胞系（A549）、大鼠腎上腺嗜鉻細胞患者行（PC12）以及宮頸癌細胞系（海拉）作為研究對象細胞，同時還用了老鼠細胞系（16種）成肌細胞作為研究細胞，中國科學(xué)院昆明動物所細胞庫是此次研究細胞的購買處，而大鼠主動脈的內(nèi)皮細胞是用此次試驗的原代進行培養(yǎng)的。

2方法

21匍匐大戟醇提物對RAECs增殖、遷移、成管及細胞通路的影響

221用免疫熒光的方法來對RAECs內(nèi)皮細胞傳至的第3代進行鑒定用胰蛋白酶進行消化，濃度為025%，在24孔板進行接種，周期是24 h，單層均勻的覆蓋在培養(yǎng)箱內(nèi)，時刻進行觀察試驗。將24孔板從培養(yǎng)箱中取出，把先前用的培養(yǎng)基去掉，用PBS進行3～4次的清洗，用中性的福爾馬林進行固定，時間是20 min；然后再用PBS進行3次的清洗，然后再對其進行孵化處理，用的試劑是含量為1%的牛血清蛋白和含量為1% Tween20的PBS，在常溫下并伴隨震蕩進行孵化，時間是120 min；然后再用PBS清洗3次，對其加入一抗（AntiCD31抗體），孵化一夜，保持4 ℃的溫度；然后再用PBS清洗3次，之后再加入FITC二抗（兔抗鼠多克隆抗體IgG）繼續(xù)孵化，保持室溫37 ℃，維持1 h，再用PBS進行3次的清洗；之后對其進行染色，染色劑是5 mg/L的DAPI，染色時間是3～5 min，再用PBS清洗3次，之后每個孔添加到PBS 500 μL后，然后采用熒光顯微鏡對細胞進行觀察。將實驗分為CD31和空白2個組別，使用一抗和二抗孵化作為CD31正常組，而CD31的對照組的添加劑是取代一抗的含量為5%的BSA，添加正常。

222RAECs增殖實驗EPlate L8細胞培養(yǎng)板將培養(yǎng)基加入到每個孔內(nèi)，將入量為50 μL，并將EPla te L8細胞培養(yǎng)板放入檢測臺進行檢測，并檢測其基線，并對實驗過程中對數(shù)期細胞懸浮液濃度的變化進行收集和計數(shù)，最后配制成實驗需要的細胞濃度2×104個/mL，5 min后對基線進行檢測，同時加入50 μL細胞懸液向EPlate檢測板中，在超凈室內(nèi)放EPlate L8細胞培養(yǎng)板，室溫放置，05 h將其放到檢測臺上進行檢測，再此過程中會有細胞的增值，并對細胞的增值進行實時的動態(tài)檢測。匍匐大戟醇提物抗腫瘤及抑制血管新生作用全貼壁后，將培養(yǎng)基加入到每個EPlate檢測板，然后開展細胞增值的實時動態(tài)試驗，連續(xù)72 h，在此過程中需要對藥物作用數(shù)據(jù)進行不斷收集。

223生長期細胞的對數(shù)選取先要消化處理胰蛋白酶，其含量為025%，計數(shù)的細胞濃度為8×104個/mL，在6孔板上進行接種。等待細胞的增長，達到90%時，在孔中劃十字線，用的是100 μL的微量移液器吸頭，將死細胞清洗掉，用的是PBS清洗液，將不同藥物濃度體積的（低劑量01 g/L，中劑量1 g/L，高劑量5 g/L）的培養(yǎng)基分別加入其中，放在CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)能夠，濃度為5%，保持恒溫37 ℃，用顯微鏡觀察0，12，24，36 h時的細胞動態(tài)，對每孔細胞進行統(tǒng)計，并將數(shù)據(jù)拍下存儲起來。

224RAECs成管實驗Matrigel提前在4 ℃冰箱冰上過夜解凍。把Matrigel鋪到96孔板中，每孔的量為50 μL，保持37 ℃的恒溫，將其放置CO2的培養(yǎng)箱中，濃度含量也為5%，時間為30 min，直到凝固為止。在這過程中，把消化細胞配合成細胞懸液，所含藥物的濃度不同，均勻配置，將含藥（藥物質(zhì)量濃度為低劑量01 g/L，中劑量1 g/L，高劑量5 g/L）細胞懸液加入到每孔中，劑量為250 μL。保持37 ℃恒溫，在CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，含量也是5%，培養(yǎng)時間為6 h，2，4，6 h的時候用顯微鏡來觀察微管的形成狀況。每孔選5個不同的部位，分別是上下左右及中間，計算出形成微管的數(shù)量，并開展統(tǒng)計學(xué)處理。

225Western blot法檢測血管生成相關(guān)信號通路在孔板中細胞長至蛋白表達90%的時候，將含有不同藥物濃度（藥物質(zhì)量濃度為低劑量01 g/L，中劑量1 g/L，高劑量5 g/L）的培養(yǎng)基加入其中，體積均相同，保持37 ℃的恒溫，在CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，含量為5%，24 h之后，從培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)瓶，用PBS進行3次的清洗，加入RIPA裂解液（內(nèi)含1% PMSF），用12 000 r/min的器皿進行離心處理，時長15 min，然后對總蛋白Bradford的法定量進行提取；蛋白樣品使用SDS聚丙烯酰胺凝膠完成離心操作，然后使用半干法完成轉(zhuǎn)膜，之后再封閉2 h，將一抗進行過夜孵化，并保持恒溫4 ℃。洗膜采用TBST，在室溫下?lián)u床孵育二抗2 h，之后顯色采用HRPECL，并使用凝膠成像儀完成掃描成像，來計算目的蛋白的表達水平，用的是目的蛋白（Akt，pAkt，eNOS，peNOS，TGFβ1，Smad3蛋白）與βactin灰度值的比值，此方法連續(xù)進行5次（n=5）。

3結(jié)果

31匍匐大戟醇提物影響RAECs的增殖作用在RAECs細胞方面匍匐大戟醇提物有一定的抑制作用，IC50為12294 g/L。

32RAECs遷移能力受到匍匐大戟醇提物的影響對比于對照組，高劑量組和陽性組在36 h內(nèi)的移動性不同，低劑量組的移動性有所降低，當(dāng)12 h后無差異，4 h內(nèi)的劑量組明顯減少，后無差異。通過上述結(jié)果可以得知，內(nèi)皮細胞受到匍匐大戟提取物的影響，其在二維水平上的遷移受到了抑制，而且劑量也過于依賴時間。

33RAECs小管形成受到了匍匐大戟醇提物的影響對比于對照組，陽性組和匍匐大戟醇提物均處于不同的時間段。能夠?qū)π」艿男纬捎幸种谱饔玫氖歉?、中、低劑量組。結(jié)果表明，匍匐大戟醇提物可以對小管形成有明顯的抑制作用，并在劑量依賴性上有所體現(xiàn)。

4討論

在人體的正常發(fā)育和許多疾病的發(fā)展中血管的形成起著非常重要的作用。從目前研究中可以看出，血管新生即是血管的生成，血管新生以2種方式體現(xiàn)：一是指萌芽成長，也稱為嵌套的增長，向內(nèi)凹陷從血管壁通過，毛細血管在促進血管腔分裂的同時，還有助于血管網(wǎng)絡(luò)的形成。而是在原有血管的基礎(chǔ)上，促進新血管形成的過程。“腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成”是udahFolkman于1971年首次提出的，在人體內(nèi)血管內(nèi)皮細胞起著很重要的作用，比如腫瘤血管生成。Jain還提出了“正常化”腫瘤血管來治療腫瘤的想法。日前醫(yī)學(xué)的研究表明，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，抗腫瘤血管生成的研究已經(jīng)成為了重點對象。此次研究的體外細胞，從研究結(jié)果可以看出來，MTT比色顯示匍匐大戟醇提物能夠?qū)δ[瘤細胞有一定的抑制作用，但是對某些細胞沒有抑制作用，比如正常的L6細胞，并且也可以從急性毒性實驗結(jié)果可以看出，在匍匐大戟醇提物在抗腫瘤和抑制血管生成中是沒有毒性的。這些結(jié)果說明匍匐大戟在抗腫瘤方面的價值非常重要；而且在RAECs遷移、增殖和成管等方面，匍匐大戟醇提物能具有一定的抑制作用，由此得出血管新生會受到匍匐大戟的抑制影響，通過匍匐大戟結(jié)果可以得知，匍匐大戟醇提物對血管內(nèi)皮功能正常蛋白AKT和eNOS磷酸化相關(guān)的信號有一定的促進作用，能夠使血管的蛋白表達和穩(wěn)定的相關(guān)信號增加，成熟蛋白對Smad3和TGFbeta 1的表達，可推測匍匐大戟在腫瘤的生長方面有一定的抑制作用，這種抑制的表現(xiàn)是通過促進血管的穩(wěn)定性和成熟來完成的；在裸鼠血清試驗中，測定裸鼠血清中VEGF、PDGFBB用的試劑盒是ELISA，結(jié)果可以看出，比較于對照組，給藥組VEGF含量在裸鼠血清中減少了，而PDGFBB在裸鼠血清中含量反而升高，由此推測匍匐大戟可對RAECs中VEGF分泌起到抑制作用，從而抑制血管新生，還可以對PDGFBB分泌有一定的促進作用，進而促進了血管的成熟性和穩(wěn)定性。該實驗結(jié)果與Western blot的研究具有一致性?？偠灾?，從一定程度上來講，匍匐大戟能夠抵抗腫瘤，而且分子機制能夠抑制腫瘤血管的新生，此過程還是對內(nèi)皮細胞的調(diào)節(jié)和血管新生相關(guān)的生長因子且分子如VEGF，PDGFBB等來完成的抑制作用，與此同時，還可以使新生血管的成熟性和穩(wěn)定性得到提升，逐漸促進腫瘤血管的正?；?。

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