曾紫凡 張惠敏 任瑩璐 焦世紅 王偉

摘要目的：探討芪參顆粒干預(yù)心力衰竭大鼠的藥效研究，并基于氧化應(yīng)激探討其作用機(jī)制。方法：制備左冠脈結(jié)扎誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、芪參顆粒組、福辛普利組。通過蘇木精伊紅染色（HE）法、Masson染色分別觀察各組大鼠心肌病理變化，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTPCR）和蛋白印跡（Western blotting）法分別檢測大鼠心肌中氧化應(yīng)激關(guān)鍵分子p47phox、RAC1的含量。結(jié)果：HE染色和Masson染色顯示模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，喪失正常結(jié)構(gòu)，心肌間質(zhì)出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤，膠原過度沉積，纖維明顯增生；而芪參顆粒與假手術(shù)組排列整齊，細(xì)胞形態(tài)基本無變化，幾乎沒有沉積的膠原蛋白。RTPCR和Western blotting顯示模型組p47phox、RAC1在mRNA與蛋白層面顯著增高；而芪參顆粒可顯著降低p47phox、RAC1的含量。結(jié)論：芪參顆粒能顯著改善左冠脈結(jié)扎誘導(dǎo)誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭，其機(jī)制可能與抑制p47phox、RAC1誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激效應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞氧化應(yīng)激；芪參顆粒；心力衰竭；大鼠；調(diào)控；機(jī)制

Mechanisms of Qishen Granules on Heart Failure Rats by Regulating Oxidative Stress

Zeng Zifan1， Zhang Huimin1， Ren Yinglu1， Jiao Shihong2， Wang Wei1

（1 School of Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2 School of Life Sciences， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

AbstractObjective：To study the effect and mechanisms of Qishen granules （QSG） on heart failure rats based on oxidative stress. Methods：Heart failure rat model was established by ligation of left coronary artery （LAD）. Rats were randomly divided into four groups including sham group， model group， QSG group and Fosinopril group. The pathological changes of heart were assessed by HematoxylinEosin （HE） and Masson′s staining. RealTime PCR and Western blot were respectively used to detect the mRNA and protein levels of p47phox and RAC1， the key molecules in oxidative stress in each group. Results：HE and Masson′s staining showed that the myocardial cells of rats in model group were disorderly arranged， and a large number of inflammatory cells were infiltrated in the interstitium. The collagen was excessively accumulated and the fibrous tissue was proliferated. On the contrast， the myocardial cells of rats in QSG and sham group were arranged in an order way and the collagen deposition was hardly observed. RealTime PCR （RTPCR） and Western blotting results showed that mRNA and protein levels of p47phox and RAC1 were increased in the model group， and QSG could significantly inhibit the expression of them. Conclusion：QSG may improve the heart function of heart failure rats induced by left anterior descending artery ligation， and its mechanisms is probably related to the inhibition of oxidative stress.

Key WordsOxidative stress； Qishen granules； Heart failure； Mechanism

中圖分類號：R2855文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.045

心力衰竭（Heart Failure，HF）是多種心血管疾病的終末階段，中醫(yī)認(rèn)為心力衰竭病大致歸屬于胸痹、心悸、水腫、等范疇，心力衰竭辨證又可分為寒凝證、血瘀證、痰濁證、陰虛證等[1]。在心力衰竭過程中，氧化應(yīng)激水平不斷增加，實(shí)驗(yàn)研究中也表明氧化應(yīng)激的增加可能導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而使心力衰竭患者病情加重。NADPH氧化酶依賴的超氧化物的產(chǎn)生是心臟氧化應(yīng)激的最重要來源。在NADPH氧化酶的眾多亞型中，Nox2型和Nox4型在心血管系統(tǒng)分布廣泛且在心力衰竭中發(fā)揮重要作用。在終末期心力衰竭患者心肌NADPH氧化酶活性增加[2]；在急性心梗患者和大鼠梗死區(qū)心肌細(xì)胞Nox2的表達(dá)顯著升高[34]；Nox2/小鼠左冠脈前降支結(jié)扎術(shù)后4周心肌肥厚、凋亡、間質(zhì)纖維化以及心功能等方面均優(yōu)于野生型小鼠，進(jìn)一步表明Nox2是心梗后心力衰竭氧化應(yīng)激的重要參與因素[5]。Nox2型的NADPH氧化酶主要位于細(xì)胞膜，由膜結(jié)合的Nox2（gp91phox）和p22phox亞基組成，但是其活化需要p67phox、p47phox、p40phox、RAC1參與組成完整的酶復(fù)合體[6]。其中，p47phox的磷酸化及易位和RAC1的易位在酶復(fù)合物的組裝和激活過程中發(fā)揮著重要作用[7]。

芪參顆粒是由黃芪、丹參、金銀花等中藥組成的復(fù)方制劑。前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，芪參顆粒具有心肌保護(hù)作用，且該藥物能針對于Nox2型NADPH氧化酶有效的改善心力衰竭大鼠的心功能。本實(shí)驗(yàn)意在進(jìn)一步研究芪參顆粒對心力衰竭大鼠心臟中p47phox和RAC1的影響，探討其抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)制。

1材料與方法

11材料

111動物SPF級正常雄性SpragueDawley（SD）大鼠90只，體重（220±10）g。購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，恒溫，恒濕，自由飲水，普通飼料。

112藥物芪參顆粒由黃芪、丹參、金銀花、甘草等6味中藥組成，各藥材飲片均購于北京同仁堂制藥有限公司，按照課題組前期建立的方法制備[9]。福辛普利由中美上海施貴寶制藥有限公司提供，國藥準(zhǔn)字H19980197。

113試劑與儀器TRIzol（Ambion，Thermo Scientific，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Scientific，USA，lot number：K1622），F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（Roche，Germany，lot number：04913914001），引物（生工生物工程股份有限公司，上海），RIPA裂解液（普利萊），蛋白酶抑制劑（Roche，Germany，lot number：04693116001），蛋白磷酸酶抑制劑（Roche，Germany，lot number：04906845001），Rac1（antiRac1 antibody，ab33186，Abcam，1：500）phosphoRac1（antiphospho Rac1 antibody，ab203884，Abcam，1：500）；p47phox（antip47phox antibody，ab795，Abcam，1：500）；phosphop47phox（antiphosphop47phox antibody，PA536773，Thermo Fisher Scientific，1：500）

12方法

121分組與模型制備90只SPF級SD大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照體重隨機(jī)分為模型組75只和假手術(shù)組15只。模型組進(jìn)行左冠脈結(jié)扎（LAD），術(shù)后進(jìn)行心電圖檢測，大鼠心電圖標(biāo)準(zhǔn)12導(dǎo)聯(lián)中出現(xiàn)6～8個(gè)導(dǎo)聯(lián)Q波的模型組大鼠納入研究范圍。

122干預(yù)方法將其中35只造模成功大鼠隨機(jī)分為3組，實(shí)驗(yàn)終末存活大鼠為：模型組10只，QSG組8只和福辛普利組6只。10只假手術(shù)組動物除穿線不結(jié)扎外，其余同模型組。QSG組為等量臨床等效劑量的兩倍（1866 g/kg）；西藥組給予福辛普利鈉片467 mg/kg，均以水溶方式每天灌胃給藥，灌胃體積為10 mL/100 g；假手術(shù)組和模型組動物給予同體積生理鹽水，連續(xù)給藥28 d后，摘取心臟，留取心臟組織進(jìn)行HE與Masson染色。

123檢測指標(biāo)與方法

1231熒光定量PCR（RealTime PCR，RTPCR）法檢測的p47phox、RAC1表達(dá)Trizol法在冰上提取細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)定量熒光PCR；2-△△Ct法分析mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1232Western blotting法檢測蛋白含量RIPA裂解緩沖液提取總蛋白；BCA法蛋白定量；蛋白上樣量50 μg/10 μL，電壓80～120 V，電泳1～15 h。將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移至NC膜，以5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，一抗與膜封入雜交袋4 ℃過夜。TBST漂洗NC膜3次，10 min/次；取出NC膜加入二抗，常溫孵育1 h，TBST洗膜3次后，滴上ECL發(fā)光液，曝光。記錄每條蛋白泳帶的灰度值進(jìn)行定量分析。

13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 200軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布者采用方差分析法進(jìn)行多組間比較，反之采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法分析，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

21病理切片HE染色結(jié)果：LAD后，假手術(shù)組心肌細(xì)胞完整，排列整齊，細(xì)胞形態(tài)基本無變化；模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌間質(zhì)出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤，喪失正常結(jié)構(gòu)。而芪參顆粒組心肌細(xì)胞形圖1各組大鼠心肌組織病理切片HE（A）與Masson染色（B）（×400）

態(tài)均勻，較少發(fā)生炎細(xì)胞浸潤，與陽性藥福辛普利組一致。Masson染色結(jié)果：光鏡下觀察，假手術(shù)組在心肌細(xì)胞中幾乎沒有沉積的膠原蛋白；而模型組心肌膠原過度沉積，纖維明顯增生，呈網(wǎng)格狀包繞心肌細(xì)胞。芪參顆粒組與陽性藥組可顯著減緩膠原沉積于纖維增生過程。

22實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測的p47phox、RAC1的mRNA表達(dá)與假手術(shù)組比較，模型組p47phox、RAC1的mRNA表達(dá)升高；與模型組比較芪參顆粒組能降低心肌組織中p47phox、RAC1的mRNA表達(dá)顯著降低，與福辛普利組作用相似。

注：與模型組比較，**P<001；與模型組比較，***P<0001；與正常組比較，△△P<001；與正常組比較，△△△P<0001

圖3Western blotting法檢測各組小鼠心肌組織中

pp47phox、p47phox、pRAC1、RAC1蛋白含量

注：與模型組比較，*P<005；與模型組比較，**P<001；與正常組比較，△P<005；與正常組比較，△△P<001

23Western blotting檢測pp47phox、p47phox、pRAC1、RAC1的蛋白表達(dá)模型組較假手術(shù)組pp47phox、pRAC1蛋白表達(dá)明顯升高，總p47phox、RAC1蛋白無明顯變化。治療后芪參顆粒組和福辛普利組的pp47phox、pRAC1蛋白表達(dá)均有下降且與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

心力衰竭是心血管系統(tǒng)疾病中的常見病，是多種器質(zhì)性心臟病患者終末階段時(shí)心臟功能代償失調(diào)的綜合征。隨著對心力衰竭疾病病理過程認(rèn)識的不斷進(jìn)步，西醫(yī)對心力衰竭的治療從短期地糾正血流動力學(xué)異常，逐步轉(zhuǎn)變?yōu)殚L期地調(diào)控神經(jīng)體液乃至試圖逆轉(zhuǎn)心肌異常著手。從“強(qiáng)心、利尿、擴(kuò)血管”的心力衰竭常規(guī)治療轉(zhuǎn)變?yōu)椤癆CEI、利尿劑、β受體阻滯劑的聯(lián)合應(yīng)用，并用或不用地高辛”。前者可以迅速緩解呼吸困難、水腫等癥狀，提高心功能；而ACEI、β受體阻滯劑治療則可促使心力衰竭病死率的下降。

雖然西醫(yī)治療心力衰竭已取得可喜的進(jìn)展，但扔存在安全系數(shù)低、適應(yīng)范圍窄、不良反應(yīng)較大等問題[10]。中醫(yī)藥采用益氣溫陽、活血利水等方法能夠減輕心力衰竭患者癥狀、提高生命質(zhì)量。芪參顆粒是本團(tuán)隊(duì)治療心力衰竭的效方，以溫陽益氣、活血解毒配伍為特色，前期研究[11]表明該方可有效改善心力衰竭大鼠心功能，調(diào)控NADPH氧化酶活性，干預(yù)氧化應(yīng)激。本研究以NOX2型NADPH氧化酶活性為切入點(diǎn)，通過建立大鼠LAD模型，采用心臟病理切片技術(shù)、定量熒光PCR法及western blotting的檢測技術(shù)，首次研究芪參顆粒對NOX2下游的p47phox、RAC 1基因和蛋白進(jìn)行定量研究。

通過本研究可以明確的結(jié)論有芪參顆?？娠@著提高LAD大鼠的心功能，減緩LAD大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變程度，抑制心肌膠原過度沉積與纖維增生。p47phox、RAC1在模型組心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)較假手術(shù)組升高即心力衰竭的確會促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生這一點(diǎn)與國內(nèi)外的研究結(jié)論一致。芪參顆粒用藥4周后對p47phox和RAC1表達(dá)的確有影響，并與福辛普利作用相似，即調(diào)控氧化應(yīng)激是芪參顆粒心肌保護(hù)作用的機(jī)制之一。

仍需進(jìn)一步研究的問題：首先，我們沒有檢測不同劑量水平芪參顆粒對氧化應(yīng)激的影響，所以劑量和效果之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。其次，雖然芪參顆粒在我們以往的研究中的成分相對清晰，但有效成分和靶點(diǎn)之間的直接關(guān)系尚不清楚。最后，我們這次只關(guān)注芪參顆粒在LAD模型動物中p47phox、RAC1表達(dá)情況。為了闡明整體情況，芪參顆粒對心力衰竭的其他模型，如主動脈弓縮窄術(shù)模型、過量異丙腎上腺素致大鼠心力衰竭模型等都需要驗(yàn)證。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中本課題組在已有實(shí)驗(yàn)結(jié)論的基礎(chǔ)上進(jìn)一步會根據(jù)不同的模型進(jìn)行多方位的驗(yàn)證探索芪參顆粒改善心功能的作用。

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