王成呂 楊魯棟 王天鵬 楊正軍 代園鳳 葛永怡

摘?要：長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）GF-10是一株具有較好生防潛力的菌株，為提高其產孢量，本研究通過單因子篩選、正交實驗，對該菌在混合基質的產孢條件及培養(yǎng)成分進行了優(yōu)化。結果表明：當培養(yǎng)基基質凈重為8 g，麥麩∶竹炭質量比為16∶1、添加5%葡萄糖、1.5‰ （NH4）2SO4、1.5‰ MgSO4、0.6%KH2PO4和0.5%混合礦質元素，pH=7，接種200 μL （1×107 個/mL）菌懸液，28℃，12 h/d光照，48 h后攪拌，培養(yǎng)7 d時，其最大產孢量為1.25×1010 個/g，比以麩皮為基質的培養(yǎng)條件提高了110.79%。本研究的開展較好的提升了長枝木霉GF-10的產孢量，為該菌的工業(yè)生產奠定了基礎。

關鍵詞：混合基質;長枝木霉GF-10;固體發(fā)酵;正交實驗

中圖分類號：Q939.96

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）06-0080-07?國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.014

木霉菌（Trichoderma spp.）歸屬于子囊菌門（Ascomycota），糞殼菌綱（Sordariomycetes），肉座菌目（Hypocreales），肉座菌科（Hypocreaceae），是一類廣泛存在于土壤中重要的廣譜拮抗生物防治菌株[1]，其同植物以及病原菌的三方互作機制[2]使得木霉菌成為一種難得的生防資源，因而被應用于農業(yè)病蟲害防治、環(huán)保等領域。在農業(yè)生產中，國際上已有50余種木霉菌生物制劑或菌肥產品獲得登記和商業(yè)化生產，在農業(yè)生產中發(fā)揮著重要作用[3]。

木霉菌不僅能夠通過競爭[4-5]、重寄生[6-7]、誘導植物抗性物質產生等作用抑制土傳病害[8-9]，而且能夠有效降解有機磷等農藥成分和促進植物生長、增強抗逆性和修復污染環(huán)境等功能[1，10-11]。近年來，一些研究發(fā)現(xiàn)長枝木霉不僅對核盤菌、細鏈格孢菌、灰霉病菌等有一定的拮抗作用，并且某些菌株還具有較強的解鹽能力[2，12-13]。因此，木霉菌劑的研發(fā)對農業(yè)生產具有重要意義，而獲得優(yōu)良的木霉菌發(fā)酵條件則是木霉菌應用的前提，它是推進木霉菌劑商業(yè)化生產的基礎。

本研究在前期研究[14]的基礎上，擬通過以混合基質為基礎培養(yǎng)基，單因子篩選、正交實驗對GF-10的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，從而進一步提升木霉菌GF-10的產孢能力，為該菌的菌劑生產節(jié)約成本。

1?材料與方法

1.1?供試菌株

實驗菌株為本實驗室分離所得長枝木霉T.longibrachiatum GF-10，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢），保藏號：CCTCC M2012383。

1.2?培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL、自然pH值。

麩皮竹炭混合基質培養(yǎng)基：以麩皮為主要成分，向其中加入竹炭作為混合基質培養(yǎng)基，依照試驗設計添加碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉），氮源（NaNO3、KNO3、（NH4）2SO4、蛋白胨、豆粉），無機鹽（MgSO4、CaCO3、CaSO4、KH2PO4、混合礦質元素）。

1.3?種子液制備

轉接4℃環(huán)境下保藏的菌種于PDA培養(yǎng)基中活化，28℃恒溫光照培養(yǎng)7 d，用含0.5%吐溫80的無菌水將孢子洗下，配制成濃度為1.0×107 個/mL的菌懸液，保存于4℃，備用。

1.4?GF-10菌株固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1?不同混合基質比值對GF-10菌株產孢的影響

按照培養(yǎng)基基質凈重為8 g的標準，將竹炭研磨成細粉狀按比例（麥麩∶竹炭=1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1、32∶1）加入到麥麩中，并設全麥麩培養(yǎng)基為對照組，每組3個重復。121℃滅菌30 min，冷卻后接種濃度為1×107 個/mL的GF-10種子液200 μL，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后對各組進行產孢量測定，稱取1 g固體混合基質于錐形瓶，加入99 mL蒸餾水與適量玻璃珠，充分震蕩搖勻后過濾、稀釋、血球計數(shù)板計產孢量。以產孢量最優(yōu)的基質配比配制培養(yǎng)基質進行后續(xù)發(fā)酵條件的篩選優(yōu)化。

1.4.2?不同培養(yǎng)周期對GF-10菌株產孢的影響

設置8個實驗組，根據(jù)1.4.1所得的培養(yǎng)基基質最優(yōu)比例，滅菌接種步驟同1.4.1，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、4、5、6、7、8、9、10 d后計數(shù)，每組做3次平行實驗。

1.4.3?不同接種濃度對GF-10菌株產孢的影響

設置5個實驗組，根據(jù)1.4.1所得的培養(yǎng)基基質最優(yōu)比例，高壓滅菌鍋于121℃滅菌30 min，分別均勻滴加濃度為1×104、1×105、1×106、1×107、1×108 個/mL的GF-10種子液200 μL，每組3個重復，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后計數(shù)，每組做3次平行實驗。

1.4.4?不同光照條件對GF-10菌株產孢的影響

設置3個實驗組，根據(jù)1.4.1所得的培養(yǎng)基基質最優(yōu)比例，滅菌接種步驟同1.4.1，于28℃培養(yǎng)箱分別進行24 h光照培養(yǎng)、12 h光照12 h黑暗交替培養(yǎng)和24 h黑暗培養(yǎng)，7 d后計數(shù)，每組做3次平行實驗。

1.4.5?不同攪拌條件對GF-10菌株產孢的影響

設置5個實驗組，根據(jù)1.4.1所得的培養(yǎng)基基質最優(yōu)比例，分別為對照組不作攪拌處理、滅菌前攪拌均勻、接種后24 h攪拌、接種后48 h攪拌、接種后72 h攪拌、接種后96 h攪拌，7 d后計數(shù)，每組做3次平行實驗。

1.4.6?不同pH值對GF-10菌株產孢的影響

設置6組實驗組，根據(jù)1.4.1所得的培養(yǎng)基基質最優(yōu)比例，用NaOH溶液和稀HCl將水的pH調成4、5、6、7、8、9與基質攪拌均勻，滅菌接種步驟同1.4.1，于28℃光照培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，7 d后計數(shù)，做3次平行實驗。

1.4.7?不同碳源對GF-10菌株產孢的影響

設置4個實驗組與1個空白對照，分別加入基質比重10%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉，滅菌接種步驟同1.4.1，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后計數(shù)，做3次平行實驗。

初篩得到最佳碳源后，分別加入總重5%、10%、15%、20%的初篩最佳碳源，滅菌接種步驟同1.4.1，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后計數(shù)，并設置對照組，做3次平行實驗。

1.4.8?不同氮源對GF-10菌株產孢的影響

設5組實驗組與1組空白對照組。分別向5組實驗組中加入1‰的（NH4）2SO4、1‰的NaNO3、1‰的KNO3、1%的蛋白胨、1%的豆粉，滅菌接種步驟同1.4.1，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后計數(shù)，做3次平行實驗。

初篩得到最佳氮源后，根據(jù)濃度梯度設置實驗組，按一定濃度添加氮源后，滅菌接種步驟同1.4.1，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后計數(shù)，做3次平行實驗。

1.4.9?MgSO4對GF-10菌株產孢的影響

設置4組實驗組與1組空白對照。分別向實驗組加入0.5‰、1‰、1.5‰、2‰的MgSO4，滅菌接種步驟同1.4.1，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后計數(shù)，做3次平行實驗。

1.4.10?KH2PO4對GF-10菌株產孢的影響

設置5組實驗組與1組空白對照。分別向實驗組加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的KH2PO4，滅菌接種步驟同1.4.1，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后計數(shù)，做3次平行實驗。

1.4.11?混合礦質元素對GF-10菌株產孢的影響

設置6組實驗組與1組空白對照。分別向實驗組加入1%、2%、3%、4%、5%、6%的混合礦質元素，滅菌接種步驟同1.4.1，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后計數(shù)，做3次平行實驗。

1.5?正交實驗

為進一步獲得木霉菌最大產孢量，在單因素條件基礎上，以產孢量作為指標，選取光照、攪拌、葡萄糖、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4、混合礦質元素這7個因素設計了3水平的正交實驗（表1）。

1.6?統(tǒng)計方法

采用軟件SPSS Statistics 22、Microsoft Excel 2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析處理。

2?結果與分析

2.1?不同混合基質比值對GF-10菌株產孢的影響

不同麩皮竹炭配比對木霉生長有不同的影響。竹炭的加入有助于發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)麩皮竹炭配比為16∶1時具有較大的綠色產孢面積，產孢量最大，最大產孢量為7.58×109 個/g。當竹炭所占比例繼續(xù)增加或減少時，產孢量呈下降趨勢。竹炭的添加使得培養(yǎng)基的均勻性較好，并且起到吸附營養(yǎng)物質及水分的作用，同時竹炭的多孔結構可以吸附更多的孢子，增大了孢子的收集率，但過多反而會使得培養(yǎng)基致密，抑制發(fā)酵。

2.2?不同培養(yǎng)周期對GF-10菌株產孢的影響

培養(yǎng)周期對菌劑的工業(yè)化生產效益具有重要影響。通過產孢量計數(shù)，小于7 d的培養(yǎng)周期中，產孢量與培養(yǎng)周期呈正相關;大于7 d的培養(yǎng)周期中，產孢量雖有小幅上升但趨于穩(wěn)定，考慮到工業(yè)培養(yǎng)的生產效益比，此處選取培養(yǎng)周期7 d進行后續(xù)試驗分析。

2.3?不同接種濃度對GF-10菌株產孢的影響

當接種濃度為1×107 個/mL時產孢量達到最大，產孢量為7.81×109個/g。接種濃度低于1×107 個/mL時，綠色產孢面積稀疏，未能充分利用培養(yǎng)空間及營養(yǎng)物質，高于1×107 個/mL時，產孢量呈下降趨勢，說明接種濃度過高造成木霉生長空間重疊，從而形成競爭抑制。

2.4?不同光照條件對GF-10菌株產孢的影響

全黑暗的培養(yǎng)條件下，木霉培養(yǎng)基表面遍布白色菌絲，產孢量低;全光照培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)表面均呈綠色，產孢量高;光照黑暗交替培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基表面也布滿綠色。產孢量進行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)12 h光暗交替培養(yǎng)與全光照培養(yǎng)條件之間產孢量差異顯著，全光照培養(yǎng)產孢量最大，其產孢量為5.56×109 個/g。

2.5?不同攪拌條件對GF-10菌株產孢的影響

攪拌能夠有效疏松培養(yǎng)基基質以防止凝塊，從而加速木霉菌對于水分的汲取與營養(yǎng)物質的吸收，進而提高木霉菌培養(yǎng)的生長速率及產孢效率。通過觀察空白對照組木霉菌的長勢，發(fā)現(xiàn)接種24 h后開始產生白色菌絲體，48 h后菌絲體明顯增多。經(jīng)產孢量計數(shù)，接種48 h后攪拌產孢量最高，產孢量為6.12×109 個/g。

2.6?不同pH值對GF-10菌株產孢的影響

通過觀察實驗組與對照組的菌株長勢并進行孢子計數(shù)，發(fā)現(xiàn)偏酸或偏堿性環(huán)境均會影響木霉的生長與產孢，pH值為7時，木霉菌株長勢最好，產孢量最大，為9.985×109 個/g。

2.7?不同碳源及添加量對GF-10菌株產孢的影響

本研究通過測試木霉菌對幾種碳源的吸收利用效率，發(fā)現(xiàn)木霉對葡萄糖的吸收利用效率較高，而淀粉等有機物質甚至還具有抑制作用。因此，本試驗設置了葡萄糖濃度梯度，發(fā)現(xiàn)葡萄糖添加量為10%時，對于木霉菌發(fā)酵的促進效果較為顯著，其最大產孢量1.15×1010 個/g。

2.8?不同氮源對GF-10菌株產孢的影響

實驗通過測試木霉菌對幾種氮源的吸收利用效率，發(fā)現(xiàn)木霉對（NH4）2SO4的吸收利用效率較高。因而以硫酸銨為氮源，進一步通過設置（NH4）2SO4濃度梯度，發(fā)現(xiàn)（NH4）2SO4添加量為0.5‰時，對于木霉菌產孢的促進效果最顯著，其最大產孢量為8.63×109 個/g。

2.9?MgSO4對GF-10菌株產孢的影響

MgSO4對GF-10菌株產孢的影響，培養(yǎng)7 d后，1‰ MgSO4處理的木霉發(fā)酵培養(yǎng)基長勢最好，高于此濃度時產孢量呈下降趨勢，但均高于對照組，說明MgSO4對于木霉發(fā)酵有一定的促進作用，最大產孢量為5.92×109 個/g。

2.10?KH2PO4對GF-10菌株產孢的影響

KH2PO4對GF-10菌株產孢的影響，培養(yǎng)7 d后，0.8%的KH2PO4處理的木霉發(fā)酵培養(yǎng)基產孢量最高，說明KH2PO4對于木霉發(fā)酵有一定的促進作用，其最大產孢量為1.027×1010 個/g。

2.11?混合礦質元素對GF-10菌株產孢的影響

培養(yǎng)7 d后，1.0%礦質元素處理的木霉發(fā)酵培養(yǎng)基產孢量最高，產孢量為7.586×109 個/g，當濃度繼續(xù)增加時，產孢量則迅速下降，這說明在培養(yǎng)基中添加微量的礦質元素能夠促進木霉產孢，而濃度過高則會對影響木霉的正常生長及產孢。

2.12?正交實驗

試驗結果的極差和方差分析可見（如表2、表3），影響木霉菌產孢的條件順序為攪拌 > 光照 > KH2PO4 > 葡萄糖 > MgSO4 > （NH4）2SO4 ?> 混合礦質元素，其中攪拌、光照、KH2PO4對產孢量的影響具有顯著意義（P<0.05）。正交實驗結果確定混合基質中木霉菌GF-10的最佳發(fā)酵工藝為48h攪拌，光照12 h/d，添加0.6%KH2PO4 、5%葡萄糖，1.5%MgSO4 、1.5%（NH4）2SO4 和0.5%的混合礦質元素。根據(jù)正交實驗結果的最佳發(fā)酵條件做驗證實驗，木霉菌GF-10的最大產孢量為1.25×1010 個/g，比以麩皮為基質的培養(yǎng)條件提高了110.79%[14]。

3?結論與討論

生防菌的固體發(fā)酵過程受培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件的影響[15]，其培養(yǎng)成分中的碳源、氮源、無機鹽等，培養(yǎng)條件中的溫度、培養(yǎng)基質的酸堿度、培養(yǎng)時間和接種量等因素都會影響到生防菌的產孢率。因此，為了充分發(fā)揮生防菌的生產能力，更好地提高其產孢率，需要對影響發(fā)酵結果的各種因子進行篩選。

本研究通過單因素篩選，以混合基質為培養(yǎng)基，采用正交實驗對長枝木霉GF-10的發(fā)酵產孢條件進行了優(yōu)化，正交實驗顯示最優(yōu)值制備的培養(yǎng)基產孢量為1.25×1010 個/g，比前期優(yōu)化所得的麥麩基質培養(yǎng)基提高110.79%[14]。本實驗中，影響木霉菌發(fā)酵工藝的主要因素是攪拌、光照、KH2PO4。

木霉菌的發(fā)酵過程中會在培養(yǎng)基表面形成菌膜，使得固體基質結團，影響了空氣的流動，導致基質內局部缺氧，從而影響微生物的生長[16]。為了防止缺氧現(xiàn)象的發(fā)生，通常采用通風、攪拌和翻動等手段來增加氧的傳遞速率，促進微生物的生長，并防止固體基質的結團[17]。本研究除采用攪拌外，在培養(yǎng)基中加入的竹炭具有多孔結構，增加了培養(yǎng)基的通氧量，進而促進了GF-10的生長及產孢;且竹炭可成為孢子吸附的基質，提升木霉菌的根部定殖能力。除通氣對GF-10產孢有影響外，光照和pH對產孢也具有重要作用;光照雖然對菌絲生長影響不明顯，但其可明顯促進孢子形成[6，18];木霉菌產孢需要一定的pH，KH2PO4不僅可以提供營養(yǎng)元素，同時對培養(yǎng)基pH的調節(jié)也具有重要作用[6，18]?？傊狙芯坎粌H提升了木霉菌GF-10在培養(yǎng)基質上的產孢效率，而且改善了該菌在大田的定殖能力，這為該菌的商品化生產和田間應用奠定了基礎。

參?考?文?獻：

[1]?景?芳，徐秉良，梁巧蘭，等.長枝木霉Trichoderma longibrachiatum T6水分散粒劑的研制[J].農藥學學報，2016，18（2）：241-248.

[2]?吉海龍，伊洪偉，池玉杰.長枝木霉菌株T05抑菌活性與拮抗機制[J].東北林業(yè)大學學報，2016，44（1）：114-119.

[3]?Vinale F，Sivasithamparam K，Ghisalberti E L，et al.Trichoderma-plant-pathogen ?interactions[J].Soil Biology and Biochemistry，2008，40（1）：1-10.

[4]?陳?捷.木霉菌生物學與應用研究-回顧與展望[J].菌物學報，2014，33（6）：1129-1135.

[5]?高克詳，劉曉光，郭潤芳.木霉菌對楊樹樹皮潰瘍病菌拮抗作用的研究[J].林業(yè)科學，2001，37（5）：82-88.

[6]?李梅云，譚麗華，方敦煌，等.哈茨木霉的培養(yǎng)及其對煙草疫霉生長的抑制研究[J].微生物學通報，2006，33（6）：89-93.

[7]?Elad Y，Kapat A.The role of Trichoderma harzianum protease in the biocontrol of Botrylis cinerea[J].European Journal of Plant Pathology，1999，11（5）：187-189.

[8]?Barak R，Elad Y，Mirelman D，et al. Lectins：A possible basis for specific recognition in the ?interaction of Trichoderma and Sclerotium rolfsii[J].Phytopathology，1985， 75（4）：458-462.

[9]?張廣志，楊合同，張新建，等.毒死蜱降解木霉菌對幾種重要植物病原真菌的生防活性[J].菌物學報，2014，33（6）：1292-1301.

[10]?Swain T.Secondary compounds as protective agents[J].Annual Review Plant Physiology，2003，28（1）：479-501.

[11]?徐?同，鐘靜萍，李德葆.木霉對土傳病原真菌的拮抗作用[J].植物病理學報， 1993（1）：65-69.

[12]?張建華，徐秉良，鄭宇宇，等.長枝木霉T6發(fā)酵液穩(wěn)定性及粗提物抑菌活性[J].農藥，2015，54（5）：330-333.

[13]?王?斌，Bakar A K，劉金亮，等.長枝木霉TlCC鑒定及其生物學特性研究[J].中國農學通報，2011，27（5）：338-345.

[14]?葛永怡，劉?陽，王天鵬，等.長枝木霉GF-10的固體發(fā)酵條件優(yōu)化[J].農藥，2017，56（1）：27-29，35.

[15]?Mamo Z，Tenkegna T A.Evaluation and optimization of agro-industrial wastes for conidial production of Trichoderma isolates under solid state fermentation[J].Journal of Applied Biosciences，2012（54）：3880-3891.

[16]?黃達明，吳其飛，陸建明，等.固態(tài)發(fā)酵技術及其設備的研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（6）：87-91.

[17]?黃達明，吳其飛，管國強，等.固態(tài)發(fā)酵蛋白飼料工藝生產線的研究[J].飼料工業(yè)，2003，24（10）：58-61.

[18]?朱茂山，關天舒，蔡大旺，等.生防木霉菌T41菌株生物學特性研究[J].沈陽農業(yè)大學學報，2008（1）：19-23.