張濤 郅軍銳 葉茂

摘?要：RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由小分子dsRNA引起目的基因mRNA序列特異性降解，導(dǎo)致靶標(biāo)基因沉默或表達(dá)量下調(diào)的現(xiàn)象。 RNAi在昆蟲重要生理酶相關(guān)基因功能的研究中起著至關(guān)重要的作用。本文主要對RNAi不同方法的應(yīng)用、各方法的優(yōu)缺點及影響RNAi效率的因素進行了綜述，總結(jié)了RNAi不同方法對昆蟲功能基因沉默效果的差異，及在昆蟲基因功能研究中的應(yīng)用進展。

關(guān)鍵詞：RNA干擾;基因功能;脫靶效應(yīng);害蟲防治

中圖分類號：S476

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）06-0063-07?國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.011

昆蟲的RNA干擾（RNA interference，RNAi）主要指外源雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的，通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄，引起內(nèi)源靶標(biāo)mRNA降解，從而導(dǎo)致靶標(biāo)基因沉默或表達(dá)量明顯下調(diào)的現(xiàn)象[1]。對于揭示昆蟲生長發(fā)育及抗性相關(guān)基因的功能具有不可或缺的作用。近年來，基于昆蟲基因組學(xué)[2-3]、轉(zhuǎn)錄組學(xué)[4]、代謝組學(xué)[5]、蛋白質(zhì)組學(xué)[6]等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展。RNAi自1998年在對秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans進行基因沉默的研究中發(fā)現(xiàn)以來[7]，RNAi技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，其應(yīng)用主要包括作物品種改良、生物防治、昆蟲抗藥性功能基因研究等方面[1]。精確地說就是應(yīng)用于基因功能和信號傳導(dǎo)通路研究[8]。近年來，RNAi技術(shù)在昆蟲基因功能方面的研究也是如火如荼，不僅可以用于控制害蟲，也可以利用RNAi保護益蟲[9]。

RNAi方法自從被發(fā)現(xiàn)至今，就備受害蟲防治研究領(lǐng)域的學(xué)者們青睞。昆蟲的RNAi因其具有較強的特異性、對環(huán)境相對友好以及高效等特點，在基因功能、抗藥性研究和害蟲防治等方面的研究不斷取得新的進展[10-11]。以模式昆蟲黑腹果蠅Drosophila melanogaster基因功能的研究為起點，國內(nèi)昆蟲RNAi研究已涉及常見8大目昆蟲[12]，比如半翅目的白背飛虱Sogatella furcifera [13]、鱗翅目的棉鈴蟲Helicoverpa armigera [14]、直翅目的東亞飛蝗 Locusta migratoria manilensis[15]、雙翅目的桔小實蠅Bactrocera dorsalis[16]、鞘翅目的馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata[17]、半翅目的中黑盲蝽Adelphocoris suturalis[18]、膜翅目的蜜蜂Bee[19]。除上述昆蟲外，RNAi技術(shù)在蜱類和螨類防治中的應(yīng)用也有一些報道[20-21]。

除上述幾個目的昆蟲外，歐美等國家對其他類別昆蟲的研究也早有報道，比如蜚蠊目[22-24]、等翅目[25-26]、脈翅目[27]、纓翅目的西花薊馬Frankliniella occidentalis[28-29]。除昆蟲外，國外對蜱[30]和螨[31-32]也建立了相應(yīng)的RNAi方法。

由于該技術(shù)對靶基因的高特異性、系統(tǒng)性及易操作性等特點，現(xiàn)已成為研究昆蟲基因功能的主要生物技術(shù)之一，且在害蟲防治等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值[33]，特別是在非模式昆蟲中[34]。但不同的RNAi方法對同一昆蟲的RNAi效果存在差異，同一RNAi方法用在不同昆蟲研究RNAi效率也存在差異。dsRNA的導(dǎo)入方法、脫靶效應(yīng)、體外合成的dsRNA易降解及高成本等問題是RNAi應(yīng)用與推廣的最大障礙，嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)會導(dǎo)致應(yīng)用RNAi進行昆蟲功能基因組學(xué)研究產(chǎn)生錯誤結(jié)論。也會因為靶標(biāo)非特異性的出現(xiàn)，而導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境安全性問題，甚至影響人類健康[35]。本文根據(jù)近年發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)對不同RNAi方法在昆蟲功能基因研究及害蟲防治研究中的應(yīng)用、以及主要存在的問題等進行綜述并展望，以期能為以后昆蟲功能基因研究中RNAi方法的選取提供參考。

1?不同RNAi方法在昆蟲功能基因研究中的應(yīng)用

RNAi技術(shù)廣泛應(yīng)用于昆蟲基因功能研究中，但由于昆蟲種類多樣性、基因多樣性以及RNAi方法多樣性等導(dǎo)致靶標(biāo)基因的沉默效率存在差異[34，37]。其干擾片段dsRNA的導(dǎo)入方法主要有顯微注射、喂食、浸泡、病毒感染、共生體介導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因方法等，其中較常用的是顯微注射法、喂食法和浸泡法[1，36]，且顯微注射法是研究昆蟲系統(tǒng)性RNAi的最適方法[12]。

1.1?顯微注射法

1.1.1?顯微注射法在昆蟲RNAi研究中的應(yīng)用

顯微注射法即將體外合成的 dsRNA 通過顯微注射儀注射到昆蟲體內(nèi)的方法。通常昆蟲的各組織部位均可注射，但由于昆蟲中腸表皮的微絨毛上含有許多通道和內(nèi)吞小體、無幾丁質(zhì)包被、較大的表皮面積等特點便于dsRNA的吸收和擴散，所以，通常選擇中腸進行注射[38]。

隨著顯微注射法在模式生物線蟲和雙翅目黑腹果蠅的RNAi研究中取得成功[7，39]。該方法便在鞘翅目、鱗翅目、膜翅目、半翅目和直翅目等昆蟲中得到廣范應(yīng)用，且成為最為有效引入dsRNA主要方法之一[36]。近兩年來，顯微注射法在昆蟲RNAi中的研究可謂是日新月異，Vatanparast 等[40]觀察了注射α-淀粉酶基因HaAMY48，Ha-AMY49和保幼激素酯酶基因Ha-JHE的dsRNA后對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)注射96 h后3類重要酶基因表達(dá)量分別下調(diào)95.8%、 97.7%和74%。Zhu等 [41]研究發(fā)現(xiàn)對褐飛虱Nilaparvata lugens注射核糖體蛋白L5基因N1RPL5 dsN1RPL5后，其mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低了65.5%，限制了褐飛虱卵巢的發(fā)育。此外，豌豆長管蚜Acyrthosiphon pisum[42]，非洲甘薯象甲[43]，大麥蟲Zophobas atratus[44]和美洲大蠊Periplaneta americana[45]等昆蟲功能基因研究也見諸報端。

在國內(nèi)也有一些報道，如楊爽等[46]使用顯微注射法將麥長管蚜Sitobion avenae Fabricius OBP7的小干擾RNA（siRNA）導(dǎo)入麥長管蚜體內(nèi)，結(jié)果證明了顯微注射方式進行RNA干擾的可行性。蔣艷冬等[47]利用顯微注射法對白背飛虱Sogatella furcifera觸角中特異性高表達(dá)的 SfOBP11進行 RNA 干擾，結(jié)果顯示，注射 SfOBP11 dsRNA 的若蟲對寄主水稻的識別能力降低。王芮等[48]采用顯微注射技術(shù)建立了超量表達(dá)灰飛虱 Laodelphax striatellus羧酸酯酶基因的果蠅品系。還有研究發(fā)現(xiàn)，對東亞飛蝗采用注射法（觸角窩注射和腹部注射）進行RNAi實驗，得出觸角窩注射法可以高效降解 LmCYP3117C1，可作為飛蝗觸角高表達(dá)基因RNAi的主要干擾方法[15]。Ren 等[49]發(fā)現(xiàn)在飛蝗腹部注射 dsRNA 不能有效地干擾卵巢高表達(dá)的基因。熊佳福等[50]顯微注射家蠅Musca domestica胚胎，成功建立Ammrjp1轉(zhuǎn)基因家蠅品系，RT-PCR證明Ammrjp1基因在轉(zhuǎn)基因家蠅中可正常轉(zhuǎn)錄。

此外，陳潔等[51]對甜菜夜蛾Spodoptera exigua進行RNAi實驗，利用注射法，成功沉默了幾丁質(zhì)酶B基因（SeCHSB），導(dǎo)致部分甜菜夜蛾出現(xiàn)蛹期畸形。王錦達(dá)[35]在赤擬谷盜Tribolium castaneum RNAi的研究表明注射不同dsRNA均可以有效抑制目標(biāo)基因的表達(dá)量（55%～75%），且能持續(xù)抑制超過7天，并導(dǎo)致78.8%～87.0%的試蟲畸形。許霽玉[52]對褐飛虱五齡末期若蟲進行RNAi實驗，得出沉默后蟲體內(nèi)卵黃蛋白基因（N1Vg）的表達(dá)量顯著降低，卵母細(xì)胞發(fā)育滯緩，產(chǎn)卵量與孵化率均顯著降低，褐飛虱的生殖能力受到一定的影響。Hu等[53]利用RNAi技術(shù)研究小菜蛾P(guān)lutella xylostella體內(nèi)細(xì)胞色素 P450 基因家族中的CYP321E1 基因，研究表明在CYP321E1 基因在小菜蛾抗藥性中起明顯作用。

1.1.2?顯微注射法優(yōu)缺點分析

顯微注射法具備明顯的優(yōu)點，主要表現(xiàn)在通過顯微注射運送ds RNA，能夠直接迅速將雙鏈 RNA 運送到目的組織或血淋巴中，避免外表皮、腸道上皮細(xì)胞等障礙。此外，能夠?qū)⒋_定數(shù)量的dsRNA 注射到昆蟲體內(nèi)[36]。而且可以引起強烈的系統(tǒng)性RNAi。該方法可將某些基因干擾效應(yīng)傳遞到子代，對于口器、生境和發(fā)育歷期的要求十分寬泛[11]。

該技術(shù)也還存在一些缺陷與不足。如顯微注射法操作技巧的要求高，操作參數(shù)需優(yōu)化，操作過程相對耗時，且不適合個體較小的昆蟲[1，36]。因為體型較小的昆蟲容易被注射操作的機械損傷而導(dǎo)致死亡，不利于實驗的進一步開展。然而隨著全細(xì)胞自動注射儀等精密儀器的發(fā)展，顯微注射法在小型昆蟲的RNAi研究中取得了一些突破性進展。李如美等[54]利用NK2 全自動細(xì)胞注射系統(tǒng)，以煙粉虱Bemisia tabaci的CYP6CM1 基因為目標(biāo)基因成功構(gòu)建了RNAi技術(shù)體系;Badillo-Vargas等[31]使用Nanoinjector II（Drummond Scientific，Broomall，PA，USA）顯微注射儀，以西花薊馬Frankliniella occidentalis的V-ATPase-B為靶標(biāo)基因進行干擾實驗，成功導(dǎo)致V-ATPase-B基因的表達(dá)量下調(diào)，致使西花薊馬死亡率升高，繁殖率下降。

1.2?飼喂法

1.2.1?飼喂法在昆蟲RNAi研究中的應(yīng)用

飼喂法即昆蟲通過取食體外合成的dsRNA/siRNA而對靶標(biāo)基因起到干擾作用的方法。近幾年來應(yīng)用飼喂法進行昆蟲的RNAi研究方興未艾。Yu和Killiny[55]利用飼喂法對亞洲柑橘木虱Diaphorina citri的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶DcGSTe2、DcGSTd1基因進行沉默，導(dǎo)致該蟲對甲氰菊酯和噻蟲嗪的敏感性增加，且通過對柑橘木虱飼喂dsRNA（dsDcGSTe2-d2）對DcGSTe2和DcGSTd1進行共沉默，導(dǎo)致了柑橘木虱對甲氰菊酯和噻蟲嗪的敏感性增加。Niu等[56]利用植物介導(dǎo)的dsRNA飼喂西方玉米根蟲Diabrotica virgifera virgifera導(dǎo)致該蟲繁殖率顯著下降。Wang等[57]用合成的dsRNA喂養(yǎng)煙粉虱成蟲導(dǎo)致Btdef基因沉默從而降低了煙粉虱體內(nèi)TYLCCNV基因的表達(dá)豐度。Ran等[58]在研究大豆食心蟲Leguminivora glycinivorella免疫相關(guān)基因LgToll-5-1a和LgPGRP-LB2a時，利用飼喂法導(dǎo)致這兩個基因表達(dá)水平下調(diào)，導(dǎo)致其發(fā)育受阻且死亡率升高。Ghosh和Gundersen-Rindal[59]用細(xì)菌表達(dá)和體外合成的dsRNA喂養(yǎng)舞毒蛾Lymantria dispar幼蟲，導(dǎo)致舞毒蛾體重下降、卵塊數(shù)減少一半。

李雪峰等[60]利用豌豆蚜Acyrthosiphon pisum基因C002序列進行RNAi試驗，結(jié)果顯示，麥長管蚜分別取食dsC002 4 d和6 d后，C002基因的表達(dá)量均下降，且差異極顯著。李曉敏等[61]對B型和Q型煙粉虱飼喂P450CYP6CM1dsRNA，研究結(jié)果表明P450CYP6CM1基因在煙粉虱抵御煙堿或新煙堿類殺蟲劑過程中起重要作用。此外，飼喂法在豌豆長管蚜[42]、非洲甘薯象甲[43]、棉鈴蟲[62]、岡比亞按蚊Anopheles gambiae [63]、東亞飛蝗[15]等昆蟲中的研究也已見諸報端。

1.2.2?飼喂法導(dǎo)入dsRNA的方式及優(yōu)缺點分析

前人的研究報道指出飼喂法導(dǎo)入dsRNA的方法主要分為3種[1，36]：第1種是在細(xì)菌中表達(dá)雙鏈RNA，通過喂食細(xì)菌實現(xiàn)的，Palli用大腸桿菌表達(dá)甜菜夜蛾幾丁質(zhì)合成酶A（Se CHSA） 的dsRNA，并混在人工培養(yǎng)基后喂食甜菜夜蛾，可成功將dsRNA傳送到幼蟲的中腸[64];第2種是在體外合成dsRNA，再把dsRNA混在食物或溶液直接給昆蟲食用，在赤擬谷盜、豌豆蚜、煙草天蛾Manduca sexta、馬鈴薯甲蟲的研究中取得成功[1，65];第3種是喂食能夠表達(dá)雙鏈RNA 的轉(zhuǎn)基因植物，目前利用轉(zhuǎn)基因植物抑制昆蟲基因表達(dá)，在鱗翅目、鞘翅目和半翅目昆蟲中得以成功實現(xiàn)[9]，且通過使昆蟲取食表達(dá) dsRNA 的植物來沉默體內(nèi)目的基因，從而達(dá)到防控蟲害的目的[66]，該方法是將RNAi技術(shù)向大田推廣應(yīng)用最具潛力方法之一。

飼喂法用于昆蟲dsRNA導(dǎo)入具有省力、省時和易操作等優(yōu)點[67]。對于高通量基因的篩選，特別是害蟲的防治，飼喂法相比于其他方法應(yīng)用性更強，且對于個體比較小的昆蟲不易對其造成機械損傷，如王暉等[68]用飼喂法成功沉默麥長管蚜與桃蚜Myzus persicae細(xì)胞色素P450基因。但飼喂法也存在不足，主要表現(xiàn)為不同物種所需量的范圍不同，需要大量的實驗進行驗證。且飼喂法由于作用較慢、效率較低、昆蟲的胚胎期和蛹期等無法取食等特點，并非所有的種都能取得成功[11，36]。

1.3?其他方法及其應(yīng)用

除上述兩種較常用方法外，其他還有如浸泡法、病毒介導(dǎo)法、轉(zhuǎn)基因法等dsRNA導(dǎo)入手段。浸泡法是將實驗材料直接浸泡在dsRNA 溶液中而引起RNAi的方法，因其方便操作，也變得越來越常見，這種方法也稱為細(xì)胞外RNAi[36]。浸泡法在昆蟲細(xì)胞系研究中應(yīng)用廣泛，在昆蟲當(dāng)中，大部分浸泡實驗主要在細(xì)胞株中實施[69]，如黑腹果蠅[70]和飛蝗[15]。

病毒介導(dǎo)法是將靶標(biāo)基因dsRNA通過病毒侵染途徑導(dǎo)入宿主體內(nèi)的方法。針對不同的目標(biāo)害蟲，需對其生活史、生活習(xí)性和發(fā)生規(guī)律進行全面了解，有目的地選擇適宜的方法進行干擾試驗，以獲得預(yù)期效果[71];轉(zhuǎn)基因法進行 RNAi的優(yōu)點在于可持續(xù)、穩(wěn)定和便利地得到 dsRNA，并且能夠遺傳，轉(zhuǎn)基因方法首先被應(yīng)用于果蠅上，通過表達(dá)雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因植物，將昆蟲基因作為靶標(biāo)，提高植物的抗蟲性[11，36，71]。此外，Whitten等[32]利用共生體介導(dǎo)的方法對西花薊馬進行RNA干擾，導(dǎo)致西花薊馬通道蛋白的mRNA表達(dá)水平下降，致使其對寄主植物的取食為害減弱，死亡率增高。

2?影響RNAi效率的因素

2.1?脫靶效應(yīng)

RNAi脫靶效應(yīng)首先是在研究人體細(xì)胞內(nèi)siRNA引導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)的，該研究結(jié)果顯示，沉默的并非靶標(biāo)基因，而是與siRNA的11個連續(xù)核苷酸序列匹配的非靶標(biāo)基因[72]。對于昆蟲的脫靶效應(yīng)而言，前人在對黑腹果蠅的研究中得出，dsRNA與mRNA的匹配長度超過19 bp后就會產(chǎn)生較高的假陽性結(jié)果[73，74]。而對于秀麗隱桿線蟲則是dsRNA與mRNA大于40 bp且相似性高于95%才會出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。

脫靶效應(yīng)的類型根據(jù)其是否引起細(xì)胞的一序列免疫應(yīng)答等原因?qū)⑵浞譃閮深悾譃樾蛄邢嚓P(guān)和序列無關(guān)，其中序列相關(guān)脫靶效應(yīng)包括：（1）siRNA分子和非鞭標(biāo)基因的互作;（2）siRNA的種子區(qū)域六聚體或七聚體與非靶標(biāo)基因3UTR區(qū)的匹配。序列無關(guān)的脫靶效應(yīng)包括：（1）外源siRNA引起內(nèi)源mircoRNA對細(xì)胞內(nèi)非靶標(biāo)基因的調(diào)節(jié)作用;（2）外源dsRNA誘導(dǎo)機體或細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答;（3）靶基因沉默，進而改變下游基因的表達(dá)即‘下游效應(yīng)。王錦達(dá)[35]對赤擬谷盜注射dsRNA（dsEGFP）后對其15個免疫應(yīng)答相關(guān)基因檢測，結(jié)果表明，可以通過免疫反應(yīng)引發(fā)赤擬谷盜序列無關(guān)基因產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。

RNAi脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生與siRNA/dsRNA的濃度有關(guān)，針對不同的物種不同的靶標(biāo)基因設(shè)計適宜濃度及適合長度的siRNA/dsRNA，有益于降低脫靶現(xiàn)象的出現(xiàn)率;通過化學(xué)修飾的方法亦可減少脫靶情況的出現(xiàn)，化學(xué)修飾通過使正義鏈?zhǔn)Щ睿ヅcRISC結(jié)合的能力，從而降低正義鏈引發(fā)的脫靶效應(yīng)。此外，通過混合siRNA/dsRNA進行干擾比單一轉(zhuǎn)染的siRNA或者dsRNA更能降低脫靶效應(yīng)[35]。

2.2?功能性靶標(biāo)基因的選擇

將 RNAi 應(yīng)用于害蟲防控領(lǐng)域，功能性靶標(biāo)基因的選擇極為重要，這些基因包括生長發(fā)育相關(guān)基因、昆蟲能量代謝相關(guān)的重要生理酶基因、生長發(fā)育相關(guān)的激素、神經(jīng)調(diào)控相關(guān)的蛋白等。就當(dāng)前已有的研究報道而言，昆蟲抗藥性相關(guān)功能基因的研究更為全面。例如，F(xiàn)ishilevich 等[75]沉默了西方玉米根蟲和新熱帶區(qū)的褐蝽Euschistus heros 染色質(zhì)重組 ATP 酶基因，結(jié)果顯示西方玉米根蟲和新熱帶區(qū)的褐蝽繁殖率顯著降低。王暉等[68]沉默了麥長管蚜和桃蚜體內(nèi)細(xì)胞色素 P450，結(jié)果隨著 dsRNA 濃度的增大和時間的推移，麥長管蚜和桃蚜的死亡率可分別達(dá)到 75.56%和 64.44%。

在昆蟲RNAi的研究中，選擇合適的靶基因和適當(dāng)?shù)膶?dǎo)入方法是其成功的關(guān)鍵。根據(jù)齊江衛(wèi)等[76]的報道，在害蟲的防治中可供選擇適宜靶標(biāo)基因主要有4類，分別為（1）害蟲致死基因，如Rieske鐵流蛋白基因沉默致使害蟲死亡;（2）害蟲抗性和免疫基因，如細(xì)胞色素P450;（3）害蟲生長發(fā)育相關(guān)基因，如幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等[55，76];（4）害蟲產(chǎn)卵相關(guān)基因，如卵黃原蛋白受阻使害蟲產(chǎn)卵量下降[77]。

2.3?dsRNA的設(shè)計及其它影響因素

設(shè)計科學(xué)合理的dsRNA是保證昆蟲RNAi取得良好效果的關(guān)鍵，因為只有適宜dsRNA進入蟲體后才能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNA干擾反應(yīng)[11]。dsRNA對RNA干擾效率的影響可歸納為以下幾點：（1）dsRNA的序列，決定生物出現(xiàn)脫靶效應(yīng)的可能性;（2）dsRNA的長度，決定了吸收和沉默的效率;（3）dsRNA的濃度，濃度越高不一定沉默效應(yīng)越強。比如在赤擬谷盜的RNA干擾研究中，在相同dsRNA濃度下，520 bp的dsRNA比69 bp的dsRNA抑制靶標(biāo)基因表達(dá)的持續(xù)時間長63 d[78]。

此外，dsRNA不穩(wěn)定性、供試?yán)ハx的發(fā)育歷期、腸道內(nèi)含物、生理PH、dsRNases、RNAi通路重疊等都對RNAi效率存在不同程度的影響[79]。就昆蟲的發(fā)育歷期而言，盡管較大的齡期便于操作，但幼齡時期往往表現(xiàn)出更強的沉默效應(yīng)，且不同基因的沉默效應(yīng)持續(xù)時間不同[11，79]。

3?小結(jié)與展望

隨著昆蟲基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、新一代高通量測序技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)的進一步發(fā)展，為我們獲取大量的基因信息提供了技術(shù)保障。RNAi 作為一種對基因表達(dá)具有特異性的抑制機制，為未知基因功能的研究提供了技術(shù)平臺，成為研究基因功能的有利工具。同時 RNAi 技術(shù)具有簡單、快速、重復(fù)性好等特性，可成為研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的新策略。不同RNAi方法對同一昆蟲的干擾效應(yīng)存在差異，比如前人研究發(fā)現(xiàn)浸泡法和涂抹法干擾飛蝗觸角的LmCYP3117C1基因效果不明顯，腹部注射法對飛蝗觸角 LmCYP3117C1 的沉默效率相對較低，唯有觸角窩注射法可以高效降解LmCYP3117C1，及注射法可作為飛蝗觸角高表達(dá)基因RNAi的主要干擾方法[15]。

目前，昆蟲RNAi 技術(shù)在昆蟲重要生理酶、生長發(fā)育、抗藥性及其滯育相關(guān)功能基因方面的研究已取得重要進展。然而在實際應(yīng)用中還存在一些棘手的問題。如 siRNA 不僅可與靶標(biāo)基因特異性結(jié)合，也可與非靶標(biāo)基因結(jié)合使其基因沉默，出現(xiàn)脫靶效應(yīng);如何使用特定的RNAi來保護植物免受害蟲侵害，但又不傷害以這些植物為食的其他物種？不同種或同種昆蟲的同一靶標(biāo)基因或不同靶標(biāo)基因，RNAi效率最好所需的dsRNA濃度？如何將RNAi技術(shù)應(yīng)用于田間害蟲的防治？如何保障飼喂法研究中體外合成的dsRNA不降解或者少降解等均是亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。RNAi 技術(shù)的研究應(yīng)用，可為害蟲的防控策略提供一種更可持續(xù)、更綠色環(huán)保的新思路，相信隨著對分子生物學(xué)研究的不斷深入，RNAi技術(shù)有望走出實驗室，向田間推廣應(yīng)用。

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