趙明　何海旺　武鵬　龍芳　 鄒瑜　李賢高　潘永杰　林志誠(chéng)　 林茜　潘曦

摘要：【目的】鑒定評(píng)價(jià)毛葡萄品種野釀2號(hào)的芽變株系Y137，為兩性花毛葡萄優(yōu)良新品種（系）提供親本材料?！痉椒ā繉?duì)野釀2號(hào)芽變株系Y137進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征、生物學(xué)特性、果實(shí)品質(zhì)特性等方面的觀察及測(cè)定，以野釀2號(hào)為對(duì)照進(jìn)行對(duì)比分析；并利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)芽變株系Y137進(jìn)行遺傳變異分析?！窘Y(jié)果】芽變株系Y137在形態(tài)學(xué)特征、生物學(xué)特性、果實(shí)品質(zhì)特性等方面與野釀2號(hào)存在明顯差異：芽變株系Y137幼果為圓形，野釀2號(hào)幼果為橢圓形；芽變株系Y137成熟期比野釀2號(hào)提早7～10 d；芽變株系Y137可溶性總糖含量和糖酸比分別比野釀2號(hào)提高66.40%和90.64%，可溶性固形物含量比野釀2號(hào)提高15.5%。篩選出的9條引物共擴(kuò)增出57條條帶，多態(tài)性條帶為7條，多態(tài)性比例為12.28%，遺傳相似系數(shù)為0.8772，說明芽變株系Y137與野釀2號(hào)的基因組DNA存在差異，但遺傳背景相似度較高。【結(jié)論】芽變株系Y137部分果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)優(yōu)于野釀2號(hào)，初步判定其為野釀2號(hào)的優(yōu)良芽變，可作為毛葡萄新品種選育及品種改良的親本材料。

關(guān)鍵詞： 毛葡萄；野釀2號(hào)；突變株系Y137；分子標(biāo)記；鑒定；果實(shí)；性狀；特性

中圖分類號(hào)： S663.103.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）09-1691-07

0 引言

【研究意義】毛葡萄（Vitis quinquangularis Rehd.）是葡萄屬真葡萄亞屬東亞種群的一個(gè)植物學(xué)種（劉崇懷等，2014），因其具有耐旱、耐貧瘠、抗性強(qiáng)等生物學(xué)特性，在廣西、貴州、云南等省（區(qū)）的石漠化地區(qū)大面積種植（趙明等，2014a）。廣西作為我國(guó)野生毛葡萄之鄉(xiāng)，人工種植毛葡萄面積居世界首位（何海旺等，2015）。但目前大多數(shù)毛葡萄品種存在果實(shí)含糖量低、含酸量高等問題（趙明等，2014b）。因此，加強(qiáng)毛葡萄種質(zhì)資源評(píng)價(jià)鑒定，培育出產(chǎn)量高、釀造品質(zhì)佳的優(yōu)良新品種，已成為當(dāng)前毛葡萄育種的當(dāng)務(wù)之急，且對(duì)促進(jìn)毛葡萄的人工栽培及其加工業(yè)的發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自1937年日本園藝學(xué)家將兩個(gè)芽變品種雜交選育出巨峰品種并被廣泛栽培后，葡萄的芽變選種引起普遍關(guān)注（劉崇懷等，2002）。我國(guó)學(xué)者于20世紀(jì)50年代開始對(duì)葡萄突變體的鑒定和利用進(jìn)行了相關(guān)研究（顧模和沈德緒，1987）。錢春（2006）對(duì)葡萄品種白香蕉芽變突變體進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方面的比較鑒定，結(jié)果表明芽變突變體果皮紅色，成熟期比白香蕉提早13 d，可溶性糖提高3.5%，商品性能明顯提高。程建徽等（2013）對(duì)葡萄品種玉手指及其芽變親本（金手指）進(jìn)行植物學(xué)和生物學(xué)特征鑒定，結(jié)果表明玉手指較其親本具有成熟早、果穗大、產(chǎn)量穩(wěn)、抗性強(qiáng)等特點(diǎn)，二者遺傳背景非常相近。方海濤等（2014）利用50條ISSR引物對(duì)巨峰及其芽變品種宇選1號(hào)進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明這2個(gè)品種遺傳背景非常相近。郭大龍等（2014）對(duì)兩個(gè)早熟芽變品種與其親本間在果實(shí)發(fā)育過程中生理指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化開展研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2個(gè)芽變品種分別與其親本品種（巨峰和京亞）間果膠甲酯酶（PE）活性和多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性變化模式相一致，且芽變品種的PG活性增長(zhǎng)速率明顯大于其親本。張國(guó)軍等（2016）利用葡萄品種瑞都香玉高接時(shí)發(fā)生的紅色芽變枝條，選育出果實(shí)紅色且有典型玫瑰香味的早熟新品種瑞都紅玉。龐鈺潔等（2017）對(duì)三本提葡萄芽變株系11-06-25進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明芽變株系果實(shí)成熟期較親本提前2周，總香氣物質(zhì)含量5231.3 μg/kg，香味更優(yōu)，是一個(gè)極早熟葡萄優(yōu)系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】葡萄芽變突變體的鑒定及評(píng)價(jià)是新品種選育的重要工作，近幾年通過芽變選種已育成一批優(yōu)良品種并在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，如華變（念紅忠等，2002）、早生高墨（王西平等，2003）及96-26（張國(guó)海等，2003）等，但目前針對(duì)毛葡萄的芽變突變體鑒定及品種選育研究仍不多。本課題組選育的兩性花毛葡萄品種野釀2號(hào)克服了原單性花品種（系）產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，成為毛葡萄生產(chǎn)上的主要栽培品種（鄒瑜等，2013），但至今未見有關(guān)野釀2號(hào)芽變株系的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】對(duì)野釀2號(hào)芽變株系Y137進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征、生物學(xué)特性、果實(shí)品質(zhì)特性等方面的觀察及測(cè)定，并利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)芽變株系Y137和野釀2號(hào)的基因組DNA進(jìn)行遺傳變異分析，探討二者遺傳差異，為選育優(yōu)良的兩性花毛葡萄新品種（系）提供優(yōu)良親本材料。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

2012年采集野釀2號(hào)芽變枝條，經(jīng)組織培養(yǎng)擴(kuò)繁獲得芽變株系Y137組培苗，并培育成營(yíng)養(yǎng)杯苗，于2013年4月與相同規(guī)格的野釀2號(hào)營(yíng)養(yǎng)杯苗一同定植于南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)金陵鎮(zhèn)毛葡萄試驗(yàn)基地。試驗(yàn)基地地勢(shì)較平坦，土壤類型為黏性紅壤，土層深厚，土壤pH 4.5～6.5，有機(jī)質(zhì)含量2.82%，排灌條件好，植株采用籬架式栽培，田間管理水平佳，植株生長(zhǎng)正常。

RNase-free水、dNTP和Taq DNA聚合酶等試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：S1000 Thermal Cycler PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)儀（Imagemaster VDS）（美國(guó)Bio-Rad公司）和DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1. 2 特性觀察及取樣

試驗(yàn)于2014─2017年進(jìn)行，分別選取并標(biāo)定長(zhǎng)勢(shì)較一致的野釀2號(hào)及其芽變株系Y137植株各15株，連續(xù)觀察并記錄其植物學(xué)和生物學(xué)特性，調(diào)查性狀的取樣量及取樣方法參照《中國(guó)葡萄志》（孔慶山，2004）。

1. 3 果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

2017年毛葡萄漿果成熟期，取果穗中部成熟一致漿果10粒，破碎混勻取果汁，采用手持折光法測(cè)定可溶性固形物含量，設(shè)3個(gè)重復(fù)?？偹?、可溶性總糖和單寧委托廣西分析測(cè)試研究中心進(jìn)行測(cè)定。總酸測(cè)定方法采用GB/T 12456—2008《食品中總酸測(cè)定方法》（酸堿滴定法）?？扇苄钥偺菂⒄誈B 5009.8─2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。單寧參照NY/T 1600─2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測(cè)定 分光光度法》進(jìn)行測(cè)定。果汁率采用GB/T 8210─2011《柑橘鮮果檢驗(yàn)方法》進(jìn)行測(cè)定。

1. 4 多態(tài)性分析

1. 4. 1 提取DNA 分別采集芽變株系Y137和野釀2號(hào)的新梢頂部嫩葉，立即用液氮速凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。參照王軍和賀普超（2000）的改良CTAB法提取其基因組DNA。

1. 4. 2 引物篩選 參考前人研究結(jié)果（張永輝等，2011；崔鵬等，2013；賴呈純等，2014），采用哥倫比亞大學(xué)（University of Columbia，UBC）公布的ISSR引物序列，從中篩選出9條多態(tài)性引物（表1），委托北京六合華大基因股份有限公司合成。

1. 4. 3 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系25.0 μL：DNA模板1.0 μL、Reaction Buffer 2.5 μL、引物2.0 μL、10 μmol/L dNTP 10.0 μL、5.0 U/μL BioReady Taq DNA聚合酶0.2 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于4 ℃保存待用或直接經(jīng)電泳和染色后，拍照并保存圖像?；跀U(kuò)增圖譜，分別以0、1統(tǒng)計(jì)建立二元數(shù)據(jù)庫(kù)：在相同電泳遷移位置，有DNA擴(kuò)增帶（顯性）記為1，無帶（隱性）記為0，依此構(gòu)建遺傳相似矩陣（僅記錄清晰、穩(wěn)定且可重復(fù)的條帶）。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用NTSYS 2.1計(jì)算遺傳相似系數(shù)，以SPSS 13.0進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 形態(tài)學(xué)特征

芽變株系Y137的特征特性：嫩梢淺紅色，直立，梢尖半開張，新葉葉柄、穗柄及嫩梢有白色絨毛，幼葉正面呈綠色且?guī)в屑t色斑，幼葉背面主脈間匍匐絨毛極密；花器類型為兩性花，每朵花有雄蕊5～6枚，以6枚為主（約占90%），雄蕊花絲直立，長(zhǎng)0.279 cm，是子房縱徑的1.56倍，開花15 d后花絲從小果上逐漸脫落；成齡葉心形，葉長(zhǎng)×葉寬為13.3 cm×10.0 cm，葉面光滑，無裂片，葉柄洼半開張，鋸齒長(zhǎng)度短，一側(cè)凸，一側(cè)凹，葉背面白色或銹色，主脈間匍匐絨毛極密，主脈上無匍匐絨毛。果穗圓錐形、緊密，成熟果粒圓形、深黑色，表面有黑點(diǎn)狀果蠟；種子褐色，可見明顯種臍。綜合上述特征特性，發(fā)現(xiàn)芽變株系Y137與野釀2號(hào)無明顯差異。二者的主要區(qū)別在于芽變株系Y137的幼果為圓形，野釀2號(hào)的幼果為橢圓形?；谠撎卣鞑町悾稍谟坠趯⒀孔冎晗礩137與野釀2號(hào)區(qū)分開來（圖1）。

2. 2 生物學(xué)特性

2. 2. 1 物候期 由表2可知，芽變株系Y137于3月下旬—4月上旬萌芽，5月上旬—中旬開花，7月下旬—8月上旬果實(shí)開始轉(zhuǎn)色，8月下旬—9月上旬果實(shí)成熟。野釀2號(hào)于4月上旬萌芽，5月中旬開花，8月上旬果實(shí)開始轉(zhuǎn)色，9月上旬果實(shí)成熟?？梢?，芽變株系Y137物候期比野釀2號(hào)提前，成熟時(shí)間提早7～10 d。上述結(jié)果為連續(xù)3年觀測(cè)結(jié)果的平均值，芽變株系Y137和野釀2號(hào)在不同年份的物候期均有所不同，其原因是氣候變化對(duì)物候期有一定的影響。

2. 2. 2 生長(zhǎng)結(jié)果習(xí)性 芽變株系Y137與野釀2號(hào)的生長(zhǎng)結(jié)果特性差異見表3。與野釀2號(hào)相比，芽變株系Y137果枝平均穗數(shù)多0.2穗，結(jié)實(shí)系數(shù)高0.6，坐果率較高7.9%（絕對(duì)值），但萌芽率和結(jié)果枝率低8.9%（絕對(duì)值）和4.0%（絕對(duì)值），以上差異均不顯著（P>0.05，下同）?？梢姡孔冎晗礩137總體表現(xiàn)為樹勢(shì)強(qiáng)健，枝梢生長(zhǎng)粗壯，細(xì)弱枝少，易形成花芽，果穗著生節(jié)位多在2～5節(jié)，結(jié)實(shí)和萌發(fā)能力強(qiáng)。

2. 2. 3 果實(shí)經(jīng)濟(jì)性狀 芽變株系Y137與野釀2號(hào)果實(shí)主要經(jīng)濟(jì)性狀差異見表4。芽變株系Y137的果穗形狀為圓錐形，少部分果穗有歧肩，果穗大小約14.6 cm×10.3 cm，與野釀2號(hào)果穗大小相近。目前，毛葡萄無專門的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)《NY/T 2563─2014》植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 葡萄果穗大小分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，芽變株系Y137屬于小果穗品種；果穗緊密度中等，平均穗重達(dá)189.0 g，略高于野釀2號(hào)，差異不顯著；平均株產(chǎn)達(dá)38.3 kg，略高于野釀2號(hào)（37.6 kg），差異不顯著，說明芽變株系Y137保持其親本野釀2號(hào)的高產(chǎn)特性。芽變株系Y137成熟果粒形狀為圓形，根據(jù)果粒大小分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬小粒品種，果皮深黑色，果蠟中等，果皮厚0.03 cm，果皮與果肉易分離，果肉和果汁黃綠色。種子卵圓形，種皮褐色，可見明顯種臍，種子大小及百粒重均比野釀2號(hào)大，其中百粒重顯著高于野釀2號(hào)（P<0.05），種子粒數(shù)2～4粒，3粒居多，平均3.3粒。綜上所述，芽變株系Y137與野釀2號(hào)果實(shí)經(jīng)濟(jì)特性基本相似。

2. 3 果實(shí)品質(zhì)特性

芽變株系Y137果粒大小整齊一致，色澤均勻美觀，外觀品質(zhì)優(yōu)良，具備毛葡萄典型的特征。由表5可知，芽變株系Y137的可溶性總糖含量7.82 g/100 g，比野釀2號(hào)高66.40%；總酸含量2.40 g/100 g，比野釀2號(hào)低12.70%；糖酸比3.26，比野釀2號(hào)高90.64%，表明芽變株系Y137果實(shí)中的糖和酸含量與野釀2號(hào)存在明顯差異；單寧和可溶性固形物含量分別比野釀2號(hào)高3.10%和15.5%。綜上所述，芽變株系Y137果實(shí)部分品質(zhì)指標(biāo)優(yōu)于野釀2號(hào)，是釀酒葡萄新品種培育的優(yōu)選材料。

2. 4 遺傳多態(tài)性分析結(jié)果

利用篩選出的9條引物對(duì)芽變株系Y137和野釀2號(hào)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。發(fā)現(xiàn)僅UBC810、UBC834、UBC836、UBC840和UBC842引物從芽變株系Y137和野釀2號(hào)中擴(kuò)增出的條帶存在差異，其他引物從芽變株系Y137和野釀2號(hào)中擴(kuò)增出的條帶基本相同。篩選出的9條引物共擴(kuò)增出57條條帶，多態(tài)性條帶為7條，多態(tài)性比例為12.28%；芽變株系Y137與野釀2號(hào)的遺傳相似系數(shù)為0.8772，說明芽變株系Y137與野釀2號(hào)的基因組存在差異，但遺傳背景相似度較高。

3 討論

芽變選種是果樹新品種選育的有效途徑之一（沈德緒，1997）。由于芽變的發(fā)生方向隨機(jī)，且受環(huán)境因素的影響存在飾變因素干擾，因此，對(duì)芽變材料分析鑒定是芽變選種的關(guān)鍵。以植物學(xué)和生物學(xué)特征特性為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)的鑒定技術(shù)可準(zhǔn)確鑒定芽變材料。吳月燕（1999）對(duì)藤稔葡萄芽變株系的生物學(xué)和植物學(xué)特征特性進(jìn)行鑒定，并對(duì)其DNA進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明，芽變株系變異特性存在不同程度的多樣性，且變異穩(wěn)定，同時(shí)證實(shí)了遺傳物質(zhì)的分化。李琳（2013）對(duì)巨峰芽變株系進(jìn)行形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明，芽變株系的嫩梢顏色、果穗重、果實(shí)品質(zhì)、生育期和基因組DNA均與母株巨峰存在明顯變異。李慧等（2014）將形態(tài)學(xué)特征和分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合對(duì)關(guān)口葡萄的品種來源和分類進(jìn)行鑒定分析。本研究對(duì)野釀2號(hào)芽變株系Y137的植物學(xué)性狀、生物學(xué)特性和果實(shí)品質(zhì)特性等方面進(jìn)行觀測(cè)，并利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)芽變株系Y137和野釀2號(hào)的基因組DNA進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果表明，芽變株系Y137的幼果形狀、物候期、可溶性總糖含量、糖酸比、可溶性固形物含量等均與野釀2號(hào)存在明顯差異，且二者在DNA水平發(fā)生變異，該芽變株系既可作為常規(guī)育種的親本材料，也可直接應(yīng)用于品種改良。

廣西人工種植毛葡萄面積居世界首位，生產(chǎn)上的主栽品種為野釀2號(hào)，具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)等特性，但該品種在釀造品質(zhì)方面仍存在改良空間。因此，培育出產(chǎn)量高、釀造品質(zhì)佳的優(yōu)良新品種，是毛葡萄育種工作的重點(diǎn)研究方向之一。本研究結(jié)果表明，芽變株系Y137的幼果形狀發(fā)生突變，其幼果為圓形，野釀2號(hào)幼果為橢圓形，該形態(tài)特征可在幼果期間將二者區(qū)分開來，成熟果粒兩者均為圓形；芽變株系Y137與野釀2號(hào)在物候期、果實(shí)經(jīng)濟(jì)性狀、果實(shí)品質(zhì)等方面均存在不同程度的差異，如芽變株系Y137成熟收獲期比野釀2號(hào)提前7～10 d，對(duì)調(diào)節(jié)產(chǎn)地釀酒葡萄原料的供應(yīng)期有積極的作用，并且有利于二次果的生產(chǎn)；芽變株系Y137可溶性總糖含量比野釀2號(hào)高66.40%，總酸含量低12.70%，糖酸比高90.64%，可作為釀酒葡萄新品種培育的基礎(chǔ)材料。利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)芽變株系Y137和野釀2號(hào)進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明，9條引物共擴(kuò)增出57條條帶，多態(tài)性條帶為7條，多態(tài)性比例為12.28%，遺傳相似系數(shù)為0.8772，說明芽變株系Y137與野釀2號(hào)的基因組存在差異，但遺傳背景相似度較高。本研究?jī)H對(duì)一個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的野釀2號(hào)毛葡萄芽變株系Y137觀測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析會(huì)影響研究結(jié)論的準(zhǔn)確性，因此需通過多年多點(diǎn)的連續(xù)重復(fù)試驗(yàn)予以驗(yàn)證。

4 結(jié)論

芽變株系Y137在形態(tài)學(xué)特征、生物學(xué)特性、果實(shí)品質(zhì)特性和基因組DNA等方面與野釀2號(hào)存在著不同程度的變異，部分果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)性狀表現(xiàn)略優(yōu)于野釀2號(hào)，初步判定其為野釀2號(hào)的優(yōu)良芽變，可作為毛葡萄新品種選育及品種改良的親本材料。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）