王松霞

[摘要]目前提取大豆作物中的油脂可采用微生物發(fā)酵法，結合單因素實驗，再配合響應曲面分析法實現對微生物的深度發(fā)酵，最終明確大豆油脂提取中所存在的諸多影響因素。本研究主要結合大豆油脂的微生物發(fā)酵實驗方法對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，分析該實驗方法的具體流程及各因素對大豆油脂提油量的影響，最后得出實驗結論。

[關鍵詞]大豆油脂；微生物發(fā)酵法；條件優(yōu)化；提油量影響

中圖分類號：TS22 文獻標識碼：A DOI：10.16465/.j.gste.cn431252ts.20180816

大豆油脂取自大豆種子，可生產制作營養(yǎng)價值較高的優(yōu)良食用油。大豆油中含有大量的棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、亞麻油酸、脂肪酸等，可顯著降低血清膽固醇含量，起到預防心血管疾病的良好功效，同時大豆油脂在醫(yī)用、工業(yè)生產中也有良好的應用。采用傳統(tǒng)大豆油制油方法產油率偏高且加工過程簡易，但大豆本身的營養(yǎng)價值容易遭到破壞，而且油脂在提取后所剩余的大豆粕被用作飼料，其潛在價值并未被完整發(fā)掘和充分利用。為此需要研究新方法來提高對大豆榨油后剩余料的有效利用，本研究對此提出了微生物發(fā)酵方法。

1大豆油脂采用微生物發(fā)酵的基本概述

目前基于大豆油脂的微生物發(fā)酵方法可實現大規(guī)模發(fā)酵產品技術優(yōu)化，其主要發(fā)酵流程包含了對菌種的選育、對培育基的配制、對培養(yǎng)及接種產品分離的有效提純等技術過程，提取大豆中的大豆油脂和大豆蛋白兩種主要成分。所以可采用產酶菌種配合發(fā)酵過程中產生的大豆中種類豐富的酶，利用微生物發(fā)酵技術分離其中的大豆油脂與大豆蛋白，最后利用微生物發(fā)酵方法提取大豆油。該方法成本低廉、工藝簡單、條件溫和且營養(yǎng)價值損失偏小，在具體的發(fā)酵過程中，主要結合菌種生長與產酶實現同步操作，專門制取大豆油的不飽和脂肪酸和亞油酸等有益成分，同時確保發(fā)酵后的食用油品質符合國家標準。

針對大豆粕的處理方法則是在提油之后再進行簡單處理，可獲得質量較高且富含小肽的大豆蛋白副產品。在本研究中則主要采用微生物發(fā)酵方法，該方法可提取大豆油發(fā)酵過程中所產生的底物與原料破碎殘渣，并對大豆油的初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等進行分析，同時考察其對提油量的影響。在該過程中還采用響應曲面分析方法，結合提油量作為響應值，分析影響微生物提油的若干因素并進行相應優(yōu)化，為微生物發(fā)酵提取大豆油脂創(chuàng)造有效的工藝環(huán)境條件。

2材料與方法

2.1材料與儀器

在開展大豆油脂的微生物發(fā)酵實驗之前要合理選擇材料和儀器。采用東北大豆配合萬能粉碎機進行粉碎，獲得豆粉，同時要用到枯草芽孢桿菌、經過選育篩選出的可產蛋白酶且性能相對穩(wěn)定的菌株、斜面培養(yǎng)基、濃度為0.05%的硫酸鎂、濃度為0.1%的磷酸二氫鉀、濃度為2%的瓊脂以及濃度為97.85%的玉米糖化液。

將上述所有物質的調垂度調整到10。選擇搖瓶作為發(fā)酵培養(yǎng)基，采用濃度為10%的天然大豆粉配合90%的水，同時加入乙醚、硫酸鎂、磷酸二氫鉀和鹽酸，最后分析提純。

在儀器設備方面選擇超凈工作臺、高壓滅菌鍋、電熱恒溫水浴鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱、高速萬能粉碎機、pH計以及振蕩培養(yǎng)箱。

2.2實驗方法

首先對大豆油脂進行發(fā)酵，并對發(fā)酵液中殘存的游離大豆油含量進行測定，可采用乙醚直接萃取，配合差重法計算出大豆油的最終獲得量。

2.2.1基于發(fā)酵條件的大豆油脂篩選實驗

（1）采用微生物分離法分解大豆油脂的底物濃度會對大豆油本身產生一定影響。在濃度為10%的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入濃度為10%的天然大豆粉，配合濃度為10%的發(fā)酵培養(yǎng)基，將pH值調整到5，在120℃的水中滅菌30min，然后接種10%的菌種，在38℃的恒溫搖床中培養(yǎng)菌種19h。最后采用發(fā)酵過程游離大豆油的含量來提高提油量，并將其作為大豆油脂底物濃度實驗的重要評價指標。

（2）大豆原料的粉碎程度也會對大豆油脂產生影響。將大豆完全粉碎后，分別過20、40、60、80和100目篩，最后經過5道目篩稱取10g的大豆粉，配合水配成濃度為10%的培養(yǎng)基。而在pH值為5、溫度為38℃條件下的恒溫搖床中則要再培養(yǎng)菌種19h，最后測量提油量。

（3）大豆油脂提取pH值對大豆油脂本身會產生影響。當大豆粉碎后過80目篩時，稱取10g的大豆粉，配成濃度為10%的天然培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基中的所有大豆粉pH值調整為6個水平：1、3、5、7、9、11，然后將大豆油脂在恒溫搖床中培養(yǎng)19h，最后測量提油量。

（4）分析培養(yǎng)溫度對大豆油脂的影響。將大豆油脂完全粉碎后過80目篩，再稱取10g的大豆粉配合水配成濃度為10%的培養(yǎng)基。將pH值調整到5，其溫度分別控制在32℃、34℃、36℃、38℃和40℃，并在恒溫搖床中培養(yǎng)19h，最后等待測量大豆提油量。同理，還要利用該方法進行發(fā)酵時間的實驗影響分析，在16h、19h、22h、25h、28h的條件下進行提油量測量提取。

2.2.2響應曲面實驗

結合響應曲面實驗設計，對單因素實驗結果進行分析，選擇合理的發(fā)酵時間，并對其pH值與培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時間等進行分析，獲得正確的大豆油脂提取響應變量。在實驗中利用Minitab軟件配合Box-Behnken原理實施響應面設計分析，然后對微生物發(fā)酵法條件下所提取的大豆油脂工藝進行有效處理。最后基于實驗因素水平的有效選取，例如在-1水平下實驗時間為16h、pH值為3，最終的大豆油脂測量提取溫度為34℃。本實驗中專門選取了15個實驗點，其中有12個為析因點，3個為零點，結合零點展開3次實驗，并執(zhí)行誤差估計計算，可獲得響應曲面實驗結果。

（1）大豆油脂底物濃度對大豆提油量的影響。一般來說，底物濃度的變化會對測定結果產生影響。如果選取底物濃度為6%的大豆油脂，將其濃度逐漸升高到10%，提油量也會隨之上升，上升趨勢明顯。但是在實驗中底物濃度不能過高，例如天然大豆培養(yǎng)，若濃度過高就會出現糊狀黏度過大的大豆產品，其基質中水分含量偏低，且在38℃的恒溫搖床中培養(yǎng)19h會導致基質中的水分進一步降低。因此綜合考量，采用微生物發(fā)酵法可提取15%左右的大豆油脂底物。

（2）原料粉碎程度對大豆提油量的影響。響應曲面實驗中的大豆原料需要粉碎，其粉碎程度會對發(fā)酵效果產生一定的影響，例如當大豆原料的粉碎程度越高、粉碎越細時其原料粉對粉碎程度要求就逐漸變高，在實際的大豆油脂生產過程中會結合該粉碎度來提高大豆油脂生產產量。在操作過程中，要基于80目篩作為粉碎基本標準，配合原料綜合考量響應曲面實驗過程與實驗條件。

（3）pH值對大豆提油量的影響。在響應曲面實驗過程中發(fā)現菌種所產生的蛋白酶對大豆粉的酶解效果明顯，而且與大豆初始pH值密切相關，pH值會影響到菌種的產酶量，直接影響大豆的提油量。如果其pH值為1～4，那么提油量就會隨著pH值的升高而逐漸升高；當pH值達到5以后，提油量升高趨勢會逐漸放緩，此時提油量也會隨之減少。因此選擇pH值為5進行發(fā)酵可獲得初始pH值，此時說明該菌種所產生的蛋白酶其pH值是偏酸性的。

（4）溫度對大豆提油量的影響。溫度在微生物法中對提油過程的影響最大、最關鍵，溫度偏高或偏低都可能會影響到微生物本身的產酶及酶的化學作用效果。例如可將溫度從30℃上升到36℃，此時大豆油脂的提油量會持續(xù)性增加，而且增加趨勢相當明顯；將溫度從36℃上升到40℃，此時提油量則會明顯下降。其下降原因主要有兩點：第一，實驗中的部分菌種在高溫狀態(tài)下失去活性死亡；第二，微生物所產生的蛋白酶在耐熱性方面表現不強，出現了變性失活的情況。綜合考量要選擇36℃為最佳的大豆油脂微生物發(fā)酵溫度。

3結果與分析

采用微生物發(fā)酵配合響應面設計實驗，最終結合回歸模型獲得發(fā)酵實驗結果。按照回歸模型系數的顯著性檢驗結果，殘差平方和為99.78%，說明該模型中的數據擬合度較高，具有一定真實性，可基于各個影響因素對大豆油脂的提油量進行綜合影響分析，而并非僅僅列出單純的線性關系。在進一步的回歸模型顯著性檢驗中，可發(fā)現回歸模型的極相當顯著，失擬項P=0.027>0.01，這說明模型的擬合度良好，可基于模型和預測生物法來分析大豆油脂中的具體油脂提取量。通過對大豆油脂響應曲面實驗結果的直觀反映，確定在培養(yǎng)溫度為38℃的條件下，大豆油脂的初始pH值為4.5～5.5，發(fā)酵時間可控制在19h內，此時提油量可達到極值，初始pH值與發(fā)酵時間兩大因素相互作用并不明顯。當初始pH值達到5時，其培養(yǎng)溫度為36℃，發(fā)酵時間為19h，提油量能夠達到極值。

4結論

本研究利用Minitab軟件結合發(fā)酵條件響應曲面優(yōu)化設計，對大豆油脂的提取方法與應用性、預測性進行了全面實驗，獲得了準確的變量與誤差信息，得出了影響微生物法在大豆油脂提油量方面的顯著因素，其顯著性影響程度從大到小依次為培養(yǎng)溫度>初始pH值>發(fā)酵時間。最后結合響應面分析方法對微生物發(fā)酵法背景下的大豆油脂提取工藝進行了進一步的深度優(yōu)化，獲得了最優(yōu)的大豆油脂發(fā)酵工藝參數，為其他相關實驗提供了相關參數指標。