顧佳緣 王琰 胡慧敏等

[摘要]本研究采用HPLC-DAD法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)曲面法（RSM）對(duì)影響稻谷中葉黃素提取效果的四氫呋喃用量、KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度和提取溫度三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立各因素與葉黃素提取量關(guān)系的數(shù)學(xué)模型。響應(yīng)曲面法優(yōu)化稻谷中葉黃素最佳提取方法為四氫呋喃15.5mL、KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度0.1g/mL、提取溫度51℃，稻谷中葉黃素提取量為（1.63±0.03）μg/g。運(yùn)用HPLC-DAD及響應(yīng)曲面法可有效縮短稻谷中葉黃素提取時(shí)間，為高效提取稻谷中的葉黃素提供了參考。

[關(guān)鍵詞]稻谷；葉黃素；響應(yīng)曲面法；HPLC-DAD

中圖分類號(hào)：TS210.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180808

葉黃素屬于類胡蘿卜素，分子式為C₄₀H₅₆O₂，結(jié)構(gòu)上由兩個(gè)六元碳環(huán)和一個(gè)含有十八個(gè)碳原子的共軛雙鍵長(zhǎng)鏈組成。葉黃素是眼部黃斑區(qū)的抗氧化劑，對(duì)老年性眼球視網(wǎng)膜黃斑退化、動(dòng)脈硬化、白內(nèi)障、心血管疾病等有預(yù)防作用，同時(shí)也可預(yù)防癌癥以及紫外線對(duì)皮膚的損傷。成熟收獲后的稻谷中含有游離的葉黃素和葉黃素酯，主要存在于最外層的果皮、胚芽和糊粉層中。人體對(duì)葉黃素酯及酯類衍生物的吸收率較差，必須先轉(zhuǎn)化為游離的葉黃素才能被人體吸收。隨著消費(fèi)者個(gè)性化需求越來越明顯，消費(fèi)觀念日趨理性，人們逐漸意識(shí)到富含葉黃素等微量營(yíng)養(yǎng)素的稻米營(yíng)養(yǎng)更豐富，研究和檢測(cè)稻米中的微量營(yíng)養(yǎng)素也逐漸受到學(xué)者的重視。

Maelle等借助HPLC-UV法及響應(yīng)面法（RSM）對(duì)葉黃素提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，取得了較好的提取效果。Boonnoun等使用液化二甲醚，配合HPLC-DAD法，提高了萬壽菊花中游離葉黃素的提取率。Fan等利用超臨界CO₂及HPLC，研究提取葉黃素的最佳條件，并建立模型提高葉黃素提取率。Cobb等采用HPLC-PDA法及響應(yīng)面法確定了玉米蛋白粉中葉黃素的最佳提取條件，并認(rèn)為葉黃素和玉米黃質(zhì)的提取量是強(qiáng)相關(guān)。Pal等應(yīng)用HPLC法和響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取參數(shù)，確定了黃玉米粒中葉黃素的最佳提取方法。

但是目前很少有對(duì)稻谷中微量葉黃素檢測(cè)的研究。葉黃素在提取過程中會(huì)受到有機(jī)溶劑及用量、KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度及用量、提取溫度、提取時(shí)間及抗氧化劑BHT添加量的影響，各個(gè)因素對(duì)葉黃素提取量的影響不同。本研究通過運(yùn)用HPLC-DAD法定量檢測(cè)稻谷中葉黃素的含量，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化各個(gè)提取條件，并建立各因素與葉黃素提取量關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，確定最佳提取方法，為高效提取與測(cè)定稻谷中葉黃素提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗(yàn)材料

稻谷（華梗5號(hào)）：宿州；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（97%）：美國(guó)Sigma公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；四氫呋喃（THF）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、正己烷、乙酸乙酯（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鉀：西隴科學(xué)股份有限公司。

1.1.2儀器

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀（配有光電二極管陣列檢測(cè)器DAD）：戴安中國(guó)有限公司；高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽：上海一恒科技有限公司；電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；N-1100D-WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司；BLH-3250實(shí)驗(yàn)礱谷機(jī)：浙江伯利恒儀器設(shè)備有限公司。

1.2葉黃素提取與色譜分析條件

1.2.1葉黃素提取

稱取一定量的稻谷樣品于礱谷機(jī)中去殼，倒入粉碎機(jī)中碾磨成粉。精確稱取1g稻谷粉，按實(shí)驗(yàn)條件分別添加有機(jī)試劑、KOH甲醇溶液和BHT后避光振蕩一段時(shí)間。過濾后的殘?jiān)貜?fù)提取一遍，合并兩次上清液于50mL離心管中。以5000r/min離心20min，轉(zhuǎn)移清液至另一離心管中，重復(fù)操作一次，合并上清液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上50℃蒸至近干，殘留物溶于2mL甲醇中，過0.45μm微孔濾膜備用。上述操作均在避光條件下進(jìn)行。

1.2.2色譜分析條件

色譜柱YMC-C30：4.6×250mm，5μm；檢測(cè)波長(zhǎng)：445nm；柱溫：35℃；流動(dòng)相：甲醇：水=95：5，等梯度洗脫；流速：0.8mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用電子天平精確稱取葉黃素標(biāo)品5mg置于50mL棕色容量瓶中，用色譜級(jí)甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配置成濃度為50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取0.5mL、1mL、2mL.4mL、6mL、8mL、10mL溶液至50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度并搖勻，制得濃度分別為0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL.4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg//mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，充氮備用。操作在昏暗條件下進(jìn)行，每個(gè)系列濃度進(jìn)樣三次，按照上述色譜條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)葉黃素的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)主要考慮不同的有機(jī)試劑及用量、KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度及用量、提取溫度和時(shí)間以及抗氧劑BHT用量對(duì)稻谷中葉黃素提取量的影響，用葉黃素提取量評(píng)價(jià)試驗(yàn)效果。

初始條件設(shè)為有機(jī)溶劑用量10mL，KOH甲醇質(zhì)量濃度為0.2g/mL，用量5mL，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為2h，BHT添加量為0.2g，研究甲醇、四氫呋喃、正己烷和乙酸乙酯對(duì)稻谷中葉黃素提取效果的影響。取上述實(shí)驗(yàn)的最佳有機(jī)溶劑，溶劑用量分別設(shè)為5mL、10mL、15mL、20mL，探究有機(jī)溶劑用量對(duì)稻谷中葉黃素提取量的影響。

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度分別為0.05g/mL、0.1g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.25g/mL。探究KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度對(duì)稻谷中葉黃素提取量的影響。繼而分別選取KOH甲醇溶液用量5mL、10mL、15mL、20mL、25mL，探究KOH甲醇溶液用量對(duì)稻谷中葉黃素提取量的影響。

選取最佳有機(jī)溶劑及用量、KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度及用量，將提取溫度設(shè)為30℃、40℃、50℃、60℃，探究提取溫度對(duì)稻谷中葉黃素提取量的影響。選取最佳提取溫度，將提取時(shí)間設(shè)為1h、2h、3h、4h，探究提取時(shí)間對(duì)稻谷中葉黃素提取量的影響。將抗氧化劑BHT的添加量分別設(shè)為0g、0.2g、0.4g、0.6g，探究BHT添加量對(duì)稻谷中葉黃素提取量的影響。

1.5稻谷中葉黃素提取量的計(jì)算

在445nm處測(cè)出峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得出質(zhì)量濃度C，根據(jù)公式計(jì)算葉黃素提取量。

式中，C為稻谷中葉黃素的質(zhì)量濃度，單位為μg/mL；V為定容體積，單位為mL；M為稻谷質(zhì)量，單位為g。

1.6響應(yīng)曲面法優(yōu)化稻谷中葉黃素提取方法

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取三個(gè)主要因子X₁、X₂、X₃進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以葉黃素的提取量為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，運(yùn)用Design Expert10.0.7軟件進(jìn)行回歸分析，確定稻谷中葉黃素的最佳提取方法。

1.7數(shù)據(jù)處理

每次測(cè)定至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理使用Design Expert 10.0.7，采用Graphpad Prism7.0等軟件進(jìn)行處理及制圖。

2結(jié)果與分析

2.1 HPLC-DAD法建立葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)色譜分析條件，繪制出葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體見圖1。線性回歸方程為y=1.348 4x-0.1749（R²=0.9995），葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.5～50μg/mL時(shí)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2回收率及精密度測(cè)定

精密度：取同一稻谷，進(jìn)行葉黃素提取，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算出葉黃素提取量的RSD為0.25%，表明精密度良好。

重復(fù)性：取同一批稻谷，稱取6份同一樣品進(jìn)行提取，計(jì)算出葉黃素提取量的RSD為0.47%，表明重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性：取同一批稻谷，在0h、2h、4h、6h、8h各測(cè)定一次，計(jì)算出葉黃素提取量的RSD為1.22%，表明樣品溶液在8h內(nèi)基本穩(wěn)定。

取6份處理好的稻谷，分別滴加1μg/mL的葉黃素對(duì)照品1mL，經(jīng)液相進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算回收量，加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。試驗(yàn)所得平均回收率為98.38%，表明該方法具有較好的回收率。

2.3單因素試驗(yàn)結(jié)果

在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)驗(yàn)試劑的安全性，選定四種試劑，分別為甲醇、四氫呋喃、正己烷、乙酸乙酯，不同有機(jī)溶劑對(duì)稻谷中葉黃素提取量的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，不同溶劑對(duì)葉黃素的提取量存在顯著差異（P<0.05）。選取四氫呋喃作有機(jī)溶劑時(shí)，稻谷中葉黃素的提取量最高，為（1.54±0.03）μg/g，正己烷、乙酸乙酯次之，甲醇最低。因此，選取四氫呋喃作為提取稻谷中葉黃素的有機(jī)溶劑。

不同條件對(duì)稻谷中葉黃素提取量的影響見圖3。

由圖3（a）可知，四氫呋喃用量對(duì)稻谷中葉黃素的提取量影響較小。原因是稻谷中游離的葉黃素含量少，四氫呋喃對(duì)葉黃素的溶解性較好，可對(duì)稻谷中的葉黃素充分溶解。據(jù)Yuhas等的研究顯示，加入四氫呋喃有利于將葉黃素與脂肪分開，提高葉黃素提取效率和回收率。另外，四氫呋喃的沸點(diǎn)較低，易通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去?？紤]到節(jié)約實(shí)驗(yàn)試劑的原則，選取四氫呋喃的用量為15mL，此時(shí)葉黃素提取量為（1.56±0.02）μg/g。

由圖3（b）可知，隨著KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度的增加，稻谷中葉黃素的提取量先增加后減少，這是由于葉黃素與溶劑的接觸面濃度差增加，滲透壓增大，葉黃素更容易浸出。當(dāng)質(zhì)量濃度過高時(shí)，溶液中堿性增加，破壞了葉黃素在溶液中的穩(wěn)定性；質(zhì)量濃度為0.15g/mL時(shí)，提取量達(dá)到最大，為（1.58±0.06）μg/g，最終選定KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度為0.15g/mL。

由圖3（c）可知，當(dāng)KOH甲醇溶液用量為5～10mL時(shí)，葉黃素的提取量逐漸升高，高于10mL后，開始有較大幅度的下降。主要原因是隨著溶液用量的增加，溶液中過強(qiáng)的堿性影響葉黃素的穩(wěn)定性，造成提取過程中的損失，最終選定KOH甲醇溶液用量為10mL。

由圖3（d）可知，稻谷中葉黃素的提取量隨著溫度的上升而增加，葉黃素提取量隨溫度變化規(guī)律與Kang等的研究一致。當(dāng)溫度到達(dá)50℃后，葉黃素中有不飽和鍵，過高的溫度易導(dǎo)致葉黃素分解和異構(gòu)化，此時(shí)不利于葉黃素的提取，所以選擇提取溫度為50℃。

由圖3（e）可知，提取時(shí)間對(duì)稻谷中葉黃素提取量的影響是先增加后減少。一開始隨著時(shí)間的增加，稻谷中游離的葉黃素可充分溶解并提取，當(dāng)提取時(shí)間到達(dá)2h后，提取體系中持續(xù)存在的高溫環(huán)境，使得葉黃素發(fā)生異構(gòu)化，影響最后的提取量，所以選取最佳提取時(shí)間為2h。提取溶液中，溶液酸堿性復(fù)雜，在酸性條件下，H⁺與葉黃素的羥基發(fā)生反應(yīng)，使葉黃素降解，添加抗氧化劑可以保持葉黃素在溶劑中的穩(wěn)定性。

由圖3（f）可知，添加0.2gBHT與沒有添加BHT相比，提取量提高了14.5%。在添加BHT之后，添加量沒有對(duì)葉黃素提取量產(chǎn)生明顯的改變，最終選定BHT添加量為0.2g。

2.4響應(yīng)曲面法優(yōu)化稻谷中葉黃素提取方法

在2.3單因素試驗(yàn)結(jié)果上，對(duì)四氫呋喃用量（X₁）、KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度（X₂）、提取溫度（X₃）3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。設(shè)響應(yīng)曲面因素與水平及編碼值見表2，響應(yīng)曲面法優(yōu)化稻谷中葉黃素提取方法見表3。

利用Design Expert對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到葉黃素提取量（Y）對(duì)X₁、X₂、X₃的二次多元回歸方程：

2.5試驗(yàn)因素交互作用分析

2.5.1四氫呋喃用量和KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度

四氫呋喃用量和KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度對(duì)稻谷中葉黃素提取量影響的響應(yīng)面（a）和等高線（b）見圖4。如圖4所示，固定提取溫度為50℃，四氫呋喃用量不變，當(dāng)KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度在0.05～0.1g/mL時(shí)，稻谷中葉黃素的提取量隨質(zhì)量濃度的增加而增加；KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度大于0.1g/mL后，葉黃素的提取量逐漸下降；KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著四氫呋喃用量的增加，葉黃素提取量先增加后減少。

2.5.2四氫呋喃用量和提取溫度

四氫呋喃用量和提取溫度對(duì)葉黃素提取量影響的響應(yīng)面和等高線見圖5。如圖5所示，固定KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，當(dāng)提取溫度一定時(shí)，稻谷中葉黃素提取量隨四氫呋喃用量的增加而增加，到達(dá)峰值后，葉黃素提取量緩慢下降；當(dāng)四氫呋喃用量不變時(shí)，提取量隨溫度的上升而增加，在溫度到達(dá)50%后，葉黃素提取量隨溫度上升而逐漸下降。

2.5.3 KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度和提取溫度

KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度和提取溫度對(duì)稻谷中葉黃素提取量影響的響應(yīng)面（a）和等高線（b）見圖6。如圖6所示，固定水平為四氫呋喃用量15mL，當(dāng)提取溫度不變，KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度在0.05～0.1g/mL時(shí)，稻谷中葉黃素的提取量隨KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度的增加而快速提高；當(dāng)KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度大于0.1g/mL時(shí)，葉黃素的提取量快速下降；在KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度恒定時(shí)，隨著溫度的升高，稻谷中葉黃素的提取量不斷增加；當(dāng)溫度高于50%時(shí)，葉黃素提取量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

2.6稻谷中葉黃素提取方法的確定

響應(yīng)曲面優(yōu)化值結(jié)果見表6。由表6可知，響應(yīng)曲面優(yōu)化后的最佳提取方法為四氫呋喃用量15.39mL、KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度0.1g/mL、提取溫度50.69℃，理論最大值為1.61μg/g。為驗(yàn)證響應(yīng)曲面法結(jié)果的可靠性，考慮到實(shí)際操作過程中的便利性，對(duì)理論最優(yōu)值調(diào)整為四氫呋喃用量15.5mL、KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度0.1g/mL、提取溫度51℃，以此作為最佳提取方法條件并重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表7。

由表7可知，3次測(cè)定取平均值為（1.63±0.03）μg/g，與理論值1.61相近（相對(duì)誤差1.22%），說明該回歸模型具有較好的擬合度。響應(yīng)面法確定的最佳提取方法下，實(shí)際葉黃素提取量比單因素條件下有所提高，這與楊秋明等的研究結(jié)果一致。通過在實(shí)際操作中優(yōu)化各因素條件，最終葉黃素提取量與回歸模型具有較好的擬合度，說明模型具有較好的參考價(jià)值。

3結(jié)論

本文探討了基于HPLC-DAD稻谷中葉黃素的提取方法，通過單因素試驗(yàn)確定了各個(gè)因素的最佳條件。應(yīng)用響應(yīng)曲面法對(duì)四氫呋喃用量、KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度和提取溫度三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立具有良好擬合度的回歸模型，得到最佳的提取方法為四氫呋喃用量15.5mL、KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度0.1g/mL、提取溫度51℃，稻谷中葉黃素提取量為（1.63±0.03）μg/g。該方法縮短了反應(yīng)時(shí)間，避免了游離葉黃素的分解和異構(gòu)化，具有較好的重復(fù)性。