楊國淋, 魏 玲

(1. 川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 南充 637000;2. 南充職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)系, 南充637131)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是生理、病理以及藥理學(xué)等醫(yī)學(xué)研究的重要手段。對于醫(yī)學(xué)研究者來說,由于臨床過程中受倫理和標(biāo)本的限制，多數(shù)研究不可能直接用人體進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 必須依賴于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[1]。因此，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是醫(yī)學(xué)生從理論到臨床實(shí)踐一個(gè)重要的橋梁。開放性實(shí)驗(yàn)是學(xué)生在已經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)了相關(guān)理論知識(shí)后，充分發(fā)揮科研思維能力和主觀能動(dòng)性，在教師的協(xié)助下完成實(shí)驗(yàn)操作和研究項(xiàng)目的過程，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中學(xué)生占實(shí)驗(yàn)者的主要位置[2]。近年來由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)有多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型被應(yīng)于醫(yī)學(xué)研究[3-5]，如膽汁性肝硬化門脈高壓模型、急性肝衰竭動(dòng)物模型、大鼠脾臟全切除模型、胃食管返流病動(dòng)物模型、管式空腸造瘺術(shù)、腦出血(ICH)動(dòng)物模型、高血壓大鼠模型和Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外科手術(shù)主要是研究在患病動(dòng)物或健康動(dòng)物體上進(jìn)行手術(shù)，以達(dá)到診斷、治療疾病和建立醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的目的，通過外科手術(shù)方法切除某些內(nèi)分泌腺或消化腺體, 進(jìn)行內(nèi)分泌、行為學(xué)和消化功能影響的研究。

脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，具有是消化吸收, 轉(zhuǎn)輸營養(yǎng)物質(zhì), 運(yùn)化水液, 統(tǒng)攝血液的關(guān)系。在傳統(tǒng)的中醫(yī)理論中，脾臟是一個(gè)十分重要的綜合器官, 不僅僅是包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中所說的脾臟，也還包括淋巴組織和胰腺組織, 若脾氣不足, 將導(dǎo)致腹瀉、食欲減退、亞健康等癥狀。Zhen等[6]用SD大鼠構(gòu)建脾氣不足的模型，探究補(bǔ)中益氣湯對脾氣不足的SD大鼠的恢復(fù)作用和潛在機(jī)制; Choi等[7]用黑砂養(yǎng)胃湯對SD大鼠不同時(shí)間段胃、脾臟、胰腺細(xì)胞的處理, 結(jié)果表明黑砂養(yǎng)胃湯有抗氧化的作用。為研究脾臟的功能, 以及脾臟切除后對消化、內(nèi)分泌、行為學(xué)的影響, 脾臟切除模型的研究也很廣泛。早在1988年葛依工等[8]對大鼠脾臟切除研究外周血T細(xì)胞亞群變化影響的動(dòng)態(tài)觀察，證實(shí)了脾臟對外周血T細(xì)胞亞群分布的調(diào)節(jié)作用。張炳俊等[9]通過對SD大鼠進(jìn)行脾切除后，然后采用線栓法建立大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral arteryocclusion，MCAO)模型，探討脾切除對大鼠腦梗塞的影響及其可能機(jī)制，研究脾臟與腦梗塞之間的關(guān)系。李梅等[10]研究脾臟切除對實(shí)驗(yàn)性腦損傷SD大鼠死亡率、血液中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的濃度以及致傷區(qū)腦組織IL-1β mRNA含量的影響,為提高重型顱腦創(chuàng)傷患者救治水平提供了新思路。

本文主要論述了我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室對SD大鼠脾臟切除開放性實(shí)驗(yàn)教學(xué)，開展此脾臟切除手術(shù)旨在培養(yǎng)醫(yī)學(xué)生的動(dòng)手能力、科研思維能力，鍛煉臨床醫(yī)學(xué)生的手術(shù)操作技巧，為他們今后從事臨床外科手術(shù)和科學(xué)研究打下基礎(chǔ)，也為其他醫(yī)學(xué)院校開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外科教學(xué)和脾臟的機(jī)制研究提供一定的參考價(jià)值。

1 動(dòng)物來源及主要器材

清潔級(jí)雄性SD大鼠, 體質(zhì)量 180～220 g, 由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(川)2013-0018]，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中[SYXK(川)2013-0076]。動(dòng)物麻醉劑: 10%水合氯醛; 常規(guī)手術(shù)器械: 組織剪、手術(shù)刀、縫合針、1號(hào)縫合線、紗布、酒精、碘伏、注射器等由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室提供。

2 大鼠脾臟切除手術(shù)具體操作流程

大鼠禁食、禁水8 h。整個(gè)手術(shù)在在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室完成，但是整個(gè)手術(shù)過程嚴(yán)格要求學(xué)生按照無菌原則進(jìn)行，避免手術(shù)過程中動(dòng)物感染。

整個(gè)大鼠脾臟切除手術(shù)嚴(yán)格模擬臨床手術(shù)過程中的注意事項(xiàng)和操作。每次實(shí)驗(yàn)一般為10個(gè)小組,3～4人為一個(gè)實(shí)驗(yàn)小組，分為主刀手、第一助手、第二助手和麻醉師，分工明確，知曉職責(zé)。在手術(shù)前先進(jìn)行理論知識(shí)的回顧和復(fù)習(xí): 主要涉及大鼠的生物學(xué)特性、解剖學(xué)特性、脾臟在解剖學(xué)上的位置、大鼠的固定、抓取，腹腔注射、無菌知識(shí)、手術(shù)器械的分類和使用、動(dòng)物福利等內(nèi)容。其次向?qū)W生介紹本開放性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)過程中的流程，主要包括: ①大鼠的固定; ②稱重; ③麻醉; ④切口;⑤結(jié)扎; ⑥脾臟切除; ⑦縫合; ⑧術(shù)后護(hù)理。

給學(xué)生播放視頻，展示脾臟切除的全過程，并在播放過程中，涉及到關(guān)鍵技術(shù)部分提醒學(xué)生注意。接下來老師對此手術(shù)示教，在示教過程中要求學(xué)生全場保持安靜。

學(xué)生開始自主實(shí)驗(yàn)，并在實(shí)驗(yàn)中給予指導(dǎo)。

2.1 大鼠的保定

在大鼠抓取的前提醒學(xué)生帶防護(hù)手套，以免被咬傷或抓傷。抓取方法: 右手輕輕抓住SD大鼠尾巴的中部并提起，然后迅速放在網(wǎng)格狀籠蓋上或其他粗糙面上，左手順勢按在大鼠軀干背部，稍加壓力向頭頸部滑行，以左手拇指和食指捏住大鼠兩耳后部頭頸皮膚，其余三指和手掌握住大鼠背部皮膚，使得大鼠的頭不能反咬，并將其保持仰臥位，完成抓取保定。大鼠保定操作如圖1和圖2。

2.2 麻醉

首先使用精度為0.1 g的電子稱重SD大鼠，然后按3 mL/kg水合氯醛(10%濃度)腹腔注射麻醉。具體操作方法如下: 左手固定好動(dòng)物，將腹部朝上。右手持注射器將針頭在下腹部白線稍左或偏右的位置，從下腹部朝頭方向平行地刺入皮下，進(jìn)針3～5 mm，再使針頭與皮膚呈45°斜穿過腹肌，當(dāng)針頭穿過腹肌進(jìn)入腹腔時(shí)，有落空感，然后固定針頭，保持針尖不動(dòng)，回抽，無回血，無腸液等, 可緩緩?fù)迫肼樽韯?。麻醉后觀察動(dòng)物的反應(yīng),2 min左右，動(dòng)物將不能自主活動(dòng)，表現(xiàn)為站立不穩(wěn), 眼睛微閉; 5 min時(shí)可見動(dòng)物完全麻醉，刺激胡須和尾尖無反應(yīng), 眼睛閉合，呼吸減慢等癥狀。

2.3 切口

待動(dòng)物完全麻醉后，用大鼠固定板，腹面朝上固定四肢和頭部，并用鑷子將舌頭延伸至嘴角，以免發(fā)生窒息。用動(dòng)物專用剃毛電推刀，將左側(cè)上腹部位置區(qū)域的毛剃干凈，裸露皮膚，找到脾臟大致位置，脾臟是在上腹部胃的下面，即左前肢內(nèi)側(cè)向下2～3指位置。找到此位置，碘伏消毒，蓋上無菌創(chuàng)巾，在創(chuàng)巾上剪開一個(gè)3 cm左右小孔，由助手將皮膚繃緊，主刀手慢慢的進(jìn)行開口1.5～2 cm(圖4)，注意開口要平整，鈍性分離肌肉層，露出腹膜，慢慢的將腹膜用鑷子提起，切開，用鈍性鑷子緩慢在腹腔內(nèi)探查脾臟(圖5，箭頭指向處為脾臟位置)。

圖1 大鼠抓取

圖2 大鼠保定

圖3 大鼠麻醉

2.4 脾臟切除及縫合

找到脾臟后，將其小心挑出，置于創(chuàng)巾上，可以清晰看見在脾系膜上有很多小血管和幾根主動(dòng)脈血管與脾臟相連，1 號(hào)線結(jié)扎脾門血管近心端和遠(yuǎn)心端，從中間切斷脾動(dòng)脈，脾臟即切除。檢查無出血后，將組織黏膜用生理鹽水沖去血漬等殘留物，然后還回腹腔。進(jìn)行縫合，縫合分為先縫合肌肉層，再縫合皮膚層，對腹膜腹肌采用連續(xù)縫合，皮膚采用斷針縫合方式(圖6)。脾臟切除手術(shù)完成后，待動(dòng)物蘇醒后，將其放在IVC籠具(類似于屏障系統(tǒng))內(nèi)單籠飼養(yǎng)，手術(shù)后溫度在25℃左右。在術(shù)后12 h內(nèi)動(dòng)物飲水里面加入20%葡萄糖或維生素C，之后按照正常飼養(yǎng)條件每日定時(shí)喂養(yǎng)，每周更換墊料2次。每日觀察動(dòng)物健康狀況，一周后記錄動(dòng)物的存活率。

3 小結(jié)與討論

如何開展動(dòng)物開放性實(shí)驗(yàn)，開展什么類型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，是目前醫(yī)學(xué)院校討論的焦點(diǎn)，多數(shù)院校也在根據(jù)學(xué)校的資源和學(xué)生素質(zhì)等基本情況，進(jìn)行不斷創(chuàng)新和探索。呂開陽等[14]將Kinect體感技術(shù)運(yùn)用于動(dòng)物開放性外科實(shí)驗(yàn)，彌補(bǔ)計(jì)算機(jī)輔助教學(xué)中的不足。動(dòng)物開放性實(shí)驗(yàn)還能培養(yǎng)醫(yī)學(xué)生的倫理意識(shí)，培養(yǎng)學(xué)生敬畏生命、善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的仁者之心[15]?；铙w動(dòng)物開放性實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚺囵B(yǎng)學(xué)生的獨(dú)立思考、動(dòng)手能力、團(tuán)隊(duì)合作能力，對于初次接觸的醫(yī)學(xué)生來說對于培養(yǎng)他們的勇氣與膽量、無菌觀念以及如何正確使用常規(guī)手術(shù)器械都有重要的意義。多數(shù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作與醫(yī)學(xué)生在以后工作中的臨床實(shí)習(xí)中具有一定的相似性，開放性實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜃寣W(xué)生更加熟練常規(guī)手術(shù)操作，同時(shí)養(yǎng)成規(guī)范熟練的動(dòng)手能力和心理素質(zhì)，為學(xué)生今后的臨床實(shí)習(xí)與醫(yī)療實(shí)踐打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

圖4 脾臟切除開口位置

圖5 大鼠腹部臟器位置

圖6 大鼠脾臟切除及縫合

建立SD大鼠脾臟切除外科手術(shù)，能夠把實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外科手術(shù)的基本知識(shí)和基本方法、基本操作原則、原理和材料等聯(lián)系起來，如手術(shù)感染途徑及消毒滅菌法, 注射需要遵循的原則及并發(fā)癥和預(yù)防處理, 麻醉的分類、方法及麻醉意外處理, 手術(shù)基本技術(shù)的組織分離的原則、組織分離方法、縫合的基本原則、縫合材料、縫合的種類、組織縫合注意事項(xiàng)等。在理論課學(xué)習(xí)的同時(shí), 實(shí)驗(yàn)課著重練習(xí)和掌握外科操作的基本技術(shù)。如動(dòng)物的抓取保定、試品的給予、 麻醉、 打結(jié)、組織分離和縫合等基本操作，也能夠充分讓學(xué)生理解和體會(huì)到動(dòng)物福利，3R原則等抽象概念。本實(shí)驗(yàn)的教學(xué)的目的是培養(yǎng)臨床醫(yī)學(xué)生外科手術(shù)的基本功底, 熟練掌握手術(shù)的基本技術(shù)和常用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)方法。

SD大鼠脾臟切除實(shí)驗(yàn)是目前研究比較成熟的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外科手術(shù)，能夠?qū)⒗碚撝R(shí)和實(shí)踐操作緊密聯(lián)系起來，培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力、心理素質(zhì)和科研思維。我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心一直將脾臟切除術(shù)作為學(xué)生的開放性實(shí)驗(yàn)，具有專業(yè)的老師授課，成熟的技術(shù)，豐富的經(jīng)驗(yàn)。每年我校學(xué)生還會(huì)定期舉辦一次全校規(guī)模的以脾臟切除手術(shù)為主的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技能操作大賽，以此加深學(xué)生對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的理解與宣傳。醫(yī)學(xué)生的臨床技能大賽、臨床手術(shù)、以及科研能力等都能得到極大的培養(yǎng)。

筆者實(shí)驗(yàn)室長期為學(xué)生開設(shè)脾臟切除外科手術(shù)，具有豐富的經(jīng)驗(yàn)。SD大鼠脾臟切除手術(shù)過程經(jīng)學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，在整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，極引導(dǎo)學(xué)生樹立善待動(dòng)物，尊重生命的倫理觀，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及“3R”原則的系統(tǒng)教育，消除學(xué)生在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中所遇到的倫理困惑，培養(yǎng)醫(yī)學(xué)生正確的科學(xué)觀。SD大鼠脾臟切除手術(shù)過程主要要注意一下幾點(diǎn): ① 麻醉的劑量，在麻醉過程中由于個(gè)體之間的差異，我們一般是先按體質(zhì)量算出麻醉劑量，腹腔注射3/4麻醉計(jì)算量，在手術(shù)過程中觀察動(dòng)物反應(yīng)，如發(fā)現(xiàn)動(dòng)物有明顯的疼痛反應(yīng)，再適當(dāng)增加麻醉劑量，不能一次性超量注射麻醉劑，因?yàn)檫^量麻醉，在脾臟切除過程中極易造成動(dòng)物中途死亡。② 開口一般保持在1.5～2 cm左右，切口平整，便于縫合，不然很容易引起動(dòng)物后期傷口感染。③ 術(shù)后護(hù)理不僅是對人很重要，對動(dòng)物也是十分重要，按照動(dòng)物福利給予足夠的關(guān)懷。一般經(jīng)過培訓(xùn)學(xué)習(xí)后，學(xué)生能獨(dú)立完成此實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)操作，并對外科手術(shù)十分感興趣。一周之后SD大鼠的傷口恢復(fù)良好，且存活率能達(dá)到90%以上。

開展此動(dòng)物開放性實(shí)驗(yàn)對于學(xué)生來說是多方面的培養(yǎng), 動(dòng)手能力，科研思維能力，心理素質(zhì)和團(tuán)隊(duì)之間的分工協(xié)作能力，望我校此外科實(shí)驗(yàn)?zāi)転槠渌t(yī)學(xué)院校的開展開放性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供一定參考。