曲雷鳴, 李 峰, 龔 偉, 劉 威

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院, 沈陽 110032; 2. 遼寧中醫(yī)藥大學藥學院, 大連116600)

鹿茸為傳統(tǒng)名貴中藥, 因具有“壯腎陽、益精血、強筋骨、調沖任、托瘡毒”等功效[1], 廣泛應用于中醫(yī)臨床與日常保健中。鹿茸由于其藥材的來源，鹿角生長特點，以及加工方式、切制的部位等差異，導致鹿茸藥材的規(guī)格紛繁復雜, 價格迥異等問題，且鹿茸藥材的藥效物質不明確, 目前尚無行之有效的方法對其進行質量控制。又因鹿茸具有強筋健骨的功效，常用于骨質疏松癥的治療。本研究嘗試采用血清藥理學方法，比較不同規(guī)格鹿茸商品藥材對骨髓間質干細胞(BMSCs)增殖及誘導成骨分化的影響，并在測定BMSCs成骨誘導分化過程中相關指標的基礎上本研究首次采用主成分分析(PCA)，為鹿茸藥材的綜合質量評價提供新的方法, 也可對鹿茸藥材規(guī)格進行科學、有效的劃分。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性SD大鼠72只, 體質量(250±20) g,由長生生物技術有限公司提供[SCXK(遼)2010-0001]。

1.2 實驗細胞

大鼠BMSCs購于賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司，批號090405B01。

1.3 實驗藥品

鹿茸藥材分別購于各藥材市場，分別為梅花鹿二杠蠟片、梅花鹿二杠二茬蠟片、梅花鹿三岔蠟片、梅花鹿二杠白片、梅花鹿二杠血片、馬鹿蓮花蠟片、馬鹿單門血片和馬鹿三岔白片，經遼寧中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室李峰老師鑒定，均為鹿科動物梅花鹿 (Cervus Nippon Temminck或馬鹿 (Cervus elaphus Linnaeus) 的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，給藥前粉碎藥材，過80目篩，加50℃蒸餾水，制成0.1 g/mL的混懸液，備用。

1.4 試劑

BMSCs完全培養(yǎng)基、BMSCs成骨分化誘導培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS), 均購自賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司; PBS平衡鹽溶液(干粉)購于中國Solarbio公司; 0.25%胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自德國Sigma公司; 大鼠堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(批號201306)、大鼠骨形成蛋白2(BMP-2)試劑盒(批號201306)、大鼠骨鈣素(BGP)試劑盒(批號201305) 均購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

1.5 儀器

Infinite M2000多功能酶標儀(奧地利Tecan公司); CK-40F200倒置顯微鏡(日本Olympus公司);MR1822型低溫高速離心機(法國Beckman公司);DHG-9241A型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司); BH-2型生物顯微鏡(日本Olympus公司);MS1型迷你振蕩器(廣州儀科有限公司)。

1.6 溶液配制

1.6.1 BMSCs不完全培養(yǎng)液 配制前的30 min，室溫溶解雙抗(青霉素、鏈霉素)5 mL, 谷氨酰胺5 mL,將培養(yǎng)基添加物各個成分加入BMSCs完全培養(yǎng)基440 mL中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 含體積分數(shù)10% FBS BMSCs完全培養(yǎng)液 將FBS放置2～8 ℃過夜至完全溶解，與BMSCs不完全培養(yǎng)基按比例配制成含體積分數(shù)10% FBS的BMSCs完全培養(yǎng)基。

1.6.3 含0.5% FBS BMSCs培養(yǎng)液 將FBS與BMSCs不完全培養(yǎng)基按比例配制成含體積分數(shù)0.5% FBS的BMSCs培養(yǎng)基。

1.6.4 不同濃度鹿茸含藥血清培養(yǎng)液 SPF級SD大鼠72只，隨機分為9組，8種不同規(guī)格鹿茸組每組8只，每日給藥劑量為4 mL/kg，灌胃鹿茸混懸液，對照組8只，灌胃等量蒸餾水。以上各組均每日給藥2次, 連續(xù)給藥5 d。末次灌胃1 h后, 10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g體質量), 行腹主動脈采血, 4 ℃冰箱靜置3 h后, 離心30 min(3 000 r/min)，收集血清，使用前用BMSCs不完全培養(yǎng)液，稀釋成10%濃度的含藥血清。

1.6.5 BMSCs成骨分化誘導培養(yǎng)基 分別將FBS 20 mL, 抗壞血酸 400 μL，β-甘油磷酸鈉 400 μL，青鏈霉素2 mL和谷氨酰胺溶液2 mL，地塞米松溶液20 μL加入BMSCs不完全培養(yǎng)液中，制成含大鼠血清為10%BMSCs成骨分化誘導培養(yǎng)基。

1.7 細胞株培養(yǎng)

大鼠BMSCs接種于50 mL培養(yǎng)瓶中, 置于37 ℃,體積分數(shù)5% CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞貼壁后, 每3 d換液1次, 繼續(xù)培養(yǎng), 待用。

1.8 鹿茸含藥血清對BMSCs增殖的影響

1.8.1 檢測方法 取生長狀態(tài)良好的BMSCs，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，用BMSCs完全培養(yǎng)液制備成單細胞懸液，調整濃度為4×l04/ mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL。將培養(yǎng)板移入37 ℃，體積分數(shù)5% CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，換用0.5% FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細胞同步化，24 h后吸棄培養(yǎng)液，實驗組分為11組，分別為:10% FBS組、10%正常大鼠血清組(空白組)、誘導液組(加入BMSCs成骨分化誘導培養(yǎng)基，作為陽性對照組)和8個不同品質鹿茸組。每組設8個復孔，每孔加入含不同血清的培養(yǎng)液 200 μL，設沒有接種細胞的培養(yǎng)孔為調零孔，分別于藥物干預24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液各10 μL，37 ℃，體積分數(shù)5% CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h后，吸棄孵育液，每孔加入DMSO 100 μL，室溫振蕩15 min，混勻，待沉淀充分溶解后，在酶標儀上測定吸光度(A)值，測定波長為570 nm。

1.8.2 檢測方法 取生長狀態(tài)良好的BMSCs, 按照傳代操作要求用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，用含10% FBS的BMSCs完全培養(yǎng)液制備成單細胞懸液，調整濃度為2×104/mL，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔體積500 μL。將培養(yǎng)板移入37 ℃，體積分數(shù)5% CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，換用0.5% FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細胞同步化，24 h后吸棄培養(yǎng)液，分別加入不同條件培養(yǎng)液500 μL，每組設4個復孔。置于37℃，體積分數(shù)5% CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每3 d換液1次。分別于6 d、12 d、18 d后，取誘導后的培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，離心10 min(3 000 r/min)，棄上清液，加PBS溶液500 μL，用移液槍反復吹打至液體內無細胞團塊。再用PBS稀釋細胞懸液，使細胞濃度達到1×106/mL左右，-20 ℃反復凍融3次, 使細胞破壞并釋放出細胞內成分, 待細胞充分破碎, 制成懸液。將細胞懸液移入1.5 mL離心管中，離心20 min(3 000 r/min)，仔細收集上清，-20 ℃凍存，備用。采用ELISA法對細胞內ALP、BMP-2、BGP蛋白酶體活性進行測定，實驗步驟見試劑盒說明書。

1.9 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理, 多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),實驗結果以表示, P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同規(guī)格鹿茸含藥血清對BMSCs細胞增殖的影響

由表1可知，不同規(guī)格鹿茸藥材含藥血清對體外培養(yǎng)BMSCs增殖均有促進作用，并且其促進作用與時間相關，含不同鹿茸血清培養(yǎng)液干預48 h后, 與空白組比較, 各組A值均顯著升高(P＜0.01)。梅花鹿二杠蠟片組、梅花鹿三岔蠟片組、馬鹿蓮花蠟片組A值均顯著高于誘導液組(P＜0.01)，鹿茸臘片對BMSCs增殖影響最為顯著。

2.2 鹿茸對BMSCs成骨分化的影響

與空白組比較，不同品質鹿茸藥材含藥血清組與誘導液組BMSCs經誘導培養(yǎng)后，ALP、BGP、BMP-2表達均有所增加(表2～4)。隨培養(yǎng)時間延長ALP表達量呈先增多、后減少的趨勢; BMP-2表達量表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢; BGP表達未現(xiàn)明顯規(guī)律。

2.3 對不同規(guī)格鹿茸進行PCA

2.3.1 數(shù)據篩選 MTT法檢測的A值表示細胞增殖情況，ALP、BGP、BMP-2是成骨細胞特異性的檢測指標，本實驗以48 h細胞增殖及12 d的ALP、BGP、BMP-2檢測結果值影響因素進行PCA(表5,6)。

表1 鹿茸含藥血清對BMSCs增殖的影響

表2 鹿茸含藥血清對BMSCs成骨分化過程中ALP活性的影響 U/L

表3 鹿茸含藥血清對BMSCs成骨分化過程中BGP活性的影響 μg/L

表4 鹿茸含藥血清對BMSCs成骨分化過程中BMP-2活性的影響 μg/L

表5 BMSCS相關指標檢測結果

2.3.2 數(shù)據的處理 化學指標數(shù)據采用Excel 2007,數(shù)據含量差異較大, 分析前先將原始數(shù)據進行標準化處理, 以消除由原始變量的量綱的不同和數(shù)據差異過大而對結果的影響, 使標準化后的數(shù)據具有可比性, 然后使用SPSS16.0軟件進行主成分, MassLynxV4.1軟件繪制主成分得分圖。

2.3.3 PCA結果 通過MassLynxV4.1軟件繪制A值和ALP值通過降維后不同規(guī)格鹿茸樣本在二維空間的分布聚類情況，結果見圖1，圖中橫坐標表示每個樣本的第一主成分得分值。縱坐標表示每個樣本的第二主成分得分值。

表6 BMSCS相關指標數(shù)據規(guī)范化結果

3 討論

本實驗以含10%大鼠鹿茸血清的培養(yǎng)液對BMSCs進行體外培養(yǎng)，MTT法檢測BMSCs細胞增殖情況，結果表明鹿茸有促進BMSCs增殖的作用，不同品質鹿茸藥材促進BMSCs增殖作用不同，培養(yǎng)48 h，作用最為顯著，鹿茸蠟片作用優(yōu)于成骨誘導液。

圖1 不同規(guī)格鹿茸第一第二主成分得分分布

ALP活性的提高是BMSCs向成骨細胞分化的重要標志，常用細胞中該酶的活性高低來檢測成骨細胞的存在和成骨細胞的分化成熟程度[2～4]。BGP反映成骨細胞活性的主要指標，在骨礦化峰期之后才出現(xiàn)積聚,是成骨細胞分化晚期的標志物[5-7]。BMP-2促進骨形成和誘導成骨細胞分化作用最為顯著[8～10]。鹿茸含藥血清可促進BMSCs成骨分化過程中ALP、BGP、BMP-2蛋白的分泌，且不同品質鹿茸中，蠟片促進BMSCs成骨分化的能力明顯高于成骨誘導液，但鹿茸對ALP、BGP、BMP-2影響并不與其品質成簡單的線性相關。鹿茸頭茬臘片對ALP影響顯著，梅花鹿茸二杠二茬蠟片與梅花鹿茸三岔蠟片對BGP影響顯著，梅花鹿二杠臘片對BMP-2影響顯著。

以不同規(guī)格鹿茸含藥血清作用于BMSCs的相關指標為變量，使用SPSS16.0軟件進行PCA，從主成分得分圖可以看出，鹿茸蠟片和鹿茸白片、血片樣本分散于第一第二空間中，即梅花鹿茸和馬鹿茸蠟片部分分布存在交叉，這與其A值及ALP值相關，A值及ALP值越接近，其在主成分圖上的重疊率越高。沒有明顯的分組現(xiàn)象。通過A值及ALP值作為分析變量在一定程度上表明了樣本之間的親緣關系。判別分析結果表明，鹿茸蠟片全判為1類，鹿茸骨片、血片全判為2類，判別符合率為100%，判別模型效果較好。