許 敏，吳婷婷，何家才

免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)緊密相關(guān)，免疫細(xì)胞直接或間接參與調(diào)控骨組織再生過程。T 淋巴細(xì)胞能夠影響破骨細(xì)胞的增殖和分化。其中 Th17細(xì)胞及其分泌的白介素(interleukin,IL)-17A 在成骨與破骨平衡過程中的作用得到越來越多的研究。同時(shí)，研究[1]報(bào)道免疫細(xì)胞可介導(dǎo)生物材料的骨免疫反應(yīng)過程。β-TCP 生物材料已被廣泛研究應(yīng)用于臨床骨再生。研究[2]表明巨噬細(xì)胞參與β-TCP 介導(dǎo)的成骨分化。目前還沒有研究報(bào)道T 淋巴細(xì)胞是否也參與了 β-TCP介導(dǎo)的骨組織再生過程。因此，該研究以β-TCP材料對T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用作為切入點(diǎn)，探討其對 Th17 細(xì)胞亞群分化的影響，同時(shí)檢測 Th17 細(xì)胞分泌的IL-17A 對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 成骨分化的調(diào)控作用，旨在為后期進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級雄性 C57BL/6 小鼠，4 周齡，體質(zhì)量(20±5) g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程對動物的處置均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、RPMI培養(yǎng)基、胰酶細(xì)胞消化液(美國Hyclone 公司) ；胎牛血清 (FBS) (美國Corning公司) ；Concanavalin A、PMA、茜素紅染色劑 (美國Sigma公司) ；紅細(xì)胞裂解液、鈣離子霉素(北京Solarbio公司) ；autoMACS (德國Miltenyi Biotec公司) ；二氧化碳孵箱 (美國Thermo公司) ；CCK8試劑 (日本同仁公司)；臺盼藍(lán)染色劑、堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 試劑盒(上海碧云天公司) ；酶標(biāo)儀 (美國Bio-tek公司) ；流式細(xì)胞檢測儀 (美國Beckman Coulter公司) ；BFA (美國Selleck公司) ；倒置激光共聚焦顯微鏡 (日本Olymbus公司) ；PCR引物 (上海生工生物工程股份有限公司) ；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 (美國Stratagene公司)；PVDF 膜(美國Invitrogen公司)。

1.2方法

1.2.1C57BL/6小鼠BMSCs的分離與培養(yǎng) 健康4周齡雄性 C57BL/6 小鼠，按照 Maniatopoulos et al[3]的方法，在無菌條件下去除表皮及肌肉等軟組織，分離小鼠后肢股骨，剪去兩端骨骺，采用注射器從骨髓腔兩端將骨髓沖出，DMEM 完全培養(yǎng)基 (含10% FBS) 制成細(xì)胞混懸液，接種至培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5 % CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，原代細(xì)胞生長7 d后待細(xì)胞融合達(dá) 80%～90%時(shí)使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 小鼠脫頸處死，取右側(cè)臥位，剪開表皮和皮下軟組織，取出脾臟置于70 μm濾網(wǎng)上，加入適量紅細(xì)胞裂解液研磨，3～5 min后加入4倍體積PBS緩沖液終止，1 500 r/min 離心5 min棄上清液，RPMI完全培養(yǎng)基 (含10% FBS) 重懸，conA (5 μg/ml) 刺激活化48～72 h。

1.2.3梯度濃度β-TCP 浸提液的制備 以 Ca(NO3)24H2O和 (NH4)2HPO4(均為上海國藥集團(tuán)) 為原始材料，采用化學(xué)沉淀法合成 β-TCP 粉末，方法如文獻(xiàn)[4]所述。β-TCP 粉劑加入不含血清RPMI培養(yǎng)基，充分混勻，37 ℃搖床孵育24 h。1 500 r/min 離心10 min，取上清液，0.22 mm 濾網(wǎng)過濾除菌。根據(jù)文獻(xiàn)[2]報(bào)道，將上清液依次對半稀釋獲得梯度濃度 β-TCP 浸提液 (200、100、50、25、12.5、6.25 mg/ml)。4 ℃保存。

1.2.4細(xì)胞活性檢測 刺激活化48～72 h的T淋巴細(xì)胞5×103/孔接種于96孔板，每孔分別加入100 μl β-TCP浸提液 (0～200 mg/ml)。每組做3個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔分別加入10 μl CCK8 buffer，37 ℃孵育3 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度值，所有定量檢測重復(fù)測定3次。

1.2.5Th17亞群分化檢測 autoMACS直接法免疫磁珠分選出CD4+T 細(xì)胞，接種于預(yù)先包被anti-CD3 (10 μg/ml) 4 ℃過夜的培養(yǎng)皿，同時(shí)加入anti-CD28 (5 μg/ml) 和IL-2 (20 μg/ml) 活化48～72 h。

CD4+T細(xì)胞2×106每孔，每孔分別加入2 ml β-TCP浸提液 (0～50 mg/ml) ，培養(yǎng)4 d。加入 PMA、BFA和鈣離子霉素封閉4～6 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)或激光共聚焦檢測，所有檢測重復(fù)3次。

1.2.6上清液中IL-17A分泌量檢測 按1.2.5方法培養(yǎng)4 d，收集孔內(nèi)上清液，ELISA法檢測上清液中IL-17A的分泌量，每組做3個(gè)重復(fù)孔，酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測，所有定量檢測重復(fù)3次。

1.2.7BMSCs成骨分化檢測 小鼠 BMSCs 3×105每孔鋪板，分別加入 β-TCP浸提液對T淋巴細(xì)胞作用后的上清液和同濃度的單獨(dú)的β-TCP 浸提液，每3 d 換液一次，在第14天和第21天采用 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測ALP和骨鈣素 (osteocalcin, OCN) 的基因表達(dá)水平，PCR引物委托上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)，引物序列見表1。第21 天分別進(jìn)行ALP 染色和茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色，同時(shí)Western blot法檢測ALP和OCN的蛋白表達(dá)，所有測定重復(fù)3次。

1.2.8IL-17A中和實(shí)驗(yàn) 在 β-TCP 浸提液對T淋巴細(xì)胞作用后的上清液中加入anti-IL-17A (10 μg/ml) 中和抗體，與小鼠BMSCs培養(yǎng)時(shí)加入，培養(yǎng)方法同1.2.7。此后每3 d換液一次，在第21天通過qRT-PCR技術(shù)檢測 β-actin、ALP 和 OCN 的基因表達(dá)水平，第21天分別進(jìn)行 ALP 染色和茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色，同時(shí)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測ALP和OCN蛋白表達(dá)水平。所有測定重復(fù)3次。

表1 PCR引物列表

2 結(jié)果

2.1T淋巴細(xì)胞活性檢測CCK8檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)72 h內(nèi)，0～50 mg/ml的 β-TCP材料浸提液促進(jìn)T淋巴細(xì)胞緩慢生長，100和200 mg/ml組明顯抑制T淋巴細(xì)胞增殖；培養(yǎng)72 h，臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，與0 mg/ml組比較，濃度為100和200 mg/ml的 β-TCP材料浸提液組活細(xì)胞/死細(xì)胞比率接近零，細(xì)胞幾乎全部死亡，具有明顯細(xì)胞毒性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=105.042,P<0.05),見圖1。

2.2β-TCP浸提液誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，0～50 mg/ml的 β-TCP浸提液能夠誘導(dǎo)Th17亞群分化，具有濃度依賴性，濃度為25 mg/ml時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生Th17細(xì)胞比例最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=134.76,P<0.05)。細(xì)胞激光共聚焦結(jié)果表明，25 mg/ml組IL-17A熒光信號最強(qiáng)。ELISA結(jié)果表明，β-TCP浸提液濃度為25 mg/ml時(shí)上清液IL-17A分泌量最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=50.98,P<0.05) ，見圖2。

圖1 β-TCP浸提液對T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活性影響

A:CCK8實(shí)驗(yàn)；B:臺盼藍(lán)染色后活細(xì)胞/死細(xì)胞比率；1: 0 mg/ml；2: 6.25 mg/ml；3: 12.5 mg/ml；4: 25 mg/ml；5： 50 mg/ml；6： 100 mg/ml；7： 200 mg/ml；與0 mg/ml組比較：*P<0.05

2.3β-TCP浸提液對T淋巴細(xì)胞作用后上清液調(diào)控BMSCs成骨分化qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對照組比較，培養(yǎng)第14 天，0～25 mg/ml的上清液組ALP和OCN基因表達(dá)水平逐漸上升，其中25 mg/ml組ALP和OCN基因的相對表達(dá)水平分別為(3.07±0.22)(F=72.43，P<0.05)、(3.52±0.69)(F=196.76，P<0.05)；在第21天，25 mg/ml組的ALP (F=15.39，P<0.05) 和OCN (F=495.34，P<0.05)基因表達(dá)上調(diào)明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與同濃度的單獨(dú) β-TCP浸提液組比較，25 mg/ml誘導(dǎo)T細(xì)胞后上清液組分別在14 d 上調(diào)表達(dá)ALP (F=573.91，P<0.05) 和OCN (F=1 608.25，P<0.05)、第21天上調(diào)表達(dá)ALP (F=436.73，P<0.05) 和OCN (F=792.96，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明 β-TCP浸提液對T淋巴細(xì)胞作用后調(diào)控BMSCs成骨分化效果更佳。與此同時(shí)，21 d的ALP染色和茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色結(jié)果也表明相同結(jié)果。第21天的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對照組ALP和OCN蛋白表達(dá)水平較低，在 β-TCP 浸提液作用于T淋巴細(xì)胞后，12.5～50 mg/ml上清液組ALP和OCN蛋白表達(dá)水平隨濃度增加而上升，均在25 mg/ml時(shí)達(dá)到最大。見圖3。

2.4IL-17A中和實(shí)驗(yàn)降低BMSCs骨向分化qRT-PCR結(jié)果顯示第21天，與未中和上清液組比較，12.5～50 mg/ml IL-17A中和組ALP和OCN的基因表達(dá)水平下調(diào)，ALP和OCN基因的相對表達(dá)量為(1.803±0.639)(F=58.988，P<0.05)、(1.617±0.782)(F=77.682，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第21天ALP染色、茜素紅染色結(jié)果表明，25 mg/ml 時(shí)，與未中和上清液組和 β-TCP 浸提液組比較，IL-17A中和組陽性染色減弱。Western blot實(shí)驗(yàn)也表明，IL-17A中和組ALP和OCN 蛋白表達(dá)水平相對下降。見圖4。

圖2 β-TCP材料浸提液對T淋巴細(xì)胞的亞群分化作用

A：流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD4和IL-17A陽性表達(dá)情況；B：流式結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析；1：0 mg/ml;2: 6.25 mg/ml; 3: 12.5 mg/ml; 4: 25 mg/ml; 5:50 mg/ml；C：細(xì)胞共聚焦檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD4和IL-17A陽性表達(dá)情況 ×60；D：ELISA法檢測共培養(yǎng)上清液中IL-17A分泌量；IgG- control: IL-17A抗體同源對照；1: 0 mg/ml；2：12.5 mg/ml；3：25 mg/ml；4：50 mg/ml；與0 mg/ml比較：*P<0.05

圖3 β-TCP浸提液與T淋巴細(xì)胞作用后上清液對小鼠BMSCs成骨分化的影響

A、B：qRT-PCR技術(shù)檢測ALP和OCN基因的表達(dá)；C：ALP染色和茜素紅染色；D:Western blot法檢測ALP、OCN蛋白表達(dá)；(-)：陰性對照組；與陰性對照組比較：*P<0.05

圖4 IL-17A中和實(shí)驗(yàn)對小鼠BMSCs成骨分化能力的影響

A、B:qRT-PCR法檢測ALP、OCN基因表達(dá)；C:ALP和茜素紅染色；D:Western blot法檢測ALP、OCN蛋白表達(dá)；(-)：陰性對照組；與陰性對照組比較：*P<0.05

3 討論

β-TCP是一種具有良好生物安全性和降解性能的骨替代生物材料，被廣泛用于臨床骨缺損的再生修復(fù)治療。2005年，Zerbo et al[5]將β-TCP用于臨床上頜竇底提升術(shù)，由于植入材料后局部炎癥反應(yīng)和部分材料降解，臨床療效不理想。與炎癥反應(yīng)和生物材料的降解吸收有關(guān)的T淋巴細(xì)胞在宿主與骨替代生物材料的相互作用中發(fā)揮著重要作用。因此，研究骨替代材料對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，有利于開發(fā)“智能”骨替代生物材料[6]，創(chuàng)造促進(jìn)成骨的免疫環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，6.25～25 mg/ml的 β-TCP浸提液能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生Th17亞群，具有濃度依賴性，表明 β-TCP浸提液對T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)促進(jìn)Th17細(xì)胞分化。

眾所周知，BMSCs是來源于骨髓的多能間充質(zhì)干細(xì)胞，具有營養(yǎng)、抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)組織再生和抗凋亡等特性[7]。研究[8]顯示，HIF-1α 介導(dǎo)的BMSCs在修復(fù)大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損中取得理想效果。然而Nauta et al[9]將BMSCs作為種子細(xì)胞，以羥基磷灰石磷酸鈣作為支架材料體內(nèi)成骨失敗。因此，一定濃度的炎癥細(xì)胞因子對于骨替代生物材料啟動和促進(jìn)BMSCs成骨分化是必需的。

IL-17A是Th17細(xì)胞分泌的主要炎性細(xì)胞因子。有研究[10]表明正畸誘導(dǎo)的牙髓炎癥微環(huán)境中的IL-17A提高牙髓干細(xì)胞的自我更新和分化，也有學(xué)者稱IL-17A能夠促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖分化能力[11]。本研究顯示，β-TCP材料浸提液對T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用后的上清液中IL-17A濃度與小鼠BMSCs的成骨分化效果相關(guān)。上清液中的IL-17A調(diào)控小鼠BMSCs的成骨分化，刺激BMSCs釋放成骨相關(guān)因子，ALP和OCN均呈現(xiàn)高水平上調(diào)，且能夠持續(xù)高水平表達(dá)。其中，ALP是成骨分化的早期標(biāo)志物，是骨礦化過程中發(fā)揮重要作用的酶[12]。OCN是成骨分化的關(guān)鍵基因。β-TCP作為公認(rèn)的能夠促進(jìn)成骨分化的骨替代材料，已被證明具有明顯的促進(jìn)BMSCs成骨分化的能力。本研究為排除 β-TCP浸提液本身對成骨過程的影響，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了同等濃度的 β-TCP浸提液組和β-TCP浸提液作用于T淋巴細(xì)胞后的上清液組。通過圖3的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)及圖4的抗體中和實(shí)驗(yàn)，均說明了β-TCP浸提液作用于T淋巴細(xì)胞后可增強(qiáng) β-TCP成骨誘導(dǎo)效果。同時(shí)，IL-17A抗體中和實(shí)驗(yàn)后的小鼠BMSCs的成骨分化能力明顯下降，表明IL-17A在提高小鼠BMSCs成骨分化能力中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，β-TCP浸提液通過對T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)Th17亞群分化，呈濃度依賴性；Th17細(xì)胞分泌IL-17A介導(dǎo)小鼠BMSCs的成骨分化，為將來體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。但目前為止，β-TCP材料誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞Th17細(xì)胞方向分化的具體分子作用機(jī)制尚不明確，且在體內(nèi)β-TCP誘導(dǎo)成骨的機(jī)制是否依賴于對T細(xì)胞的調(diào)控，仍需要進(jìn)一步研究。