林小娟 唐 毅△ 陳建豪 鄭 偉 鄭智楷 楊凌杰

1) 福建省立醫(yī)院北院 福建省老年醫(yī)院 福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 福州 350003 2)福建省立醫(yī)院康復(fù)科，福建 福州 350003

脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs) 是近年來(lái)從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。許多研究表明[1-2]ADSCs移植有利于腦缺血大鼠神經(jīng)功能的康復(fù)。在這個(gè)過(guò)程中，血管新生對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用至關(guān)重要，尤其在新生血管的萌芽階段[3-5]。1994年，SATO等[6-8]第一次識(shí)別MT1-MMP，是第一種被鑒定錨定在細(xì)胞膜上的不可溶性的基質(zhì)金屬蛋白酶，并發(fā)現(xiàn)它在血管新生中起著重要作用。MT1-MMP可以在缺血局部降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的有效成分，并在血管穩(wěn)定中起關(guān)鍵作用，同時(shí)其能減少滲漏并促進(jìn)血管新生[9]。在體外實(shí)驗(yàn)中，大量證據(jù)表明MT1-MMP可促進(jìn)外周血管新生[10-13]，但在促進(jìn)腦血管新生方面研究較少。本研究旨在建立穩(wěn)定的大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型，通過(guò)檢測(cè)ADSCs移植后大鼠腦組織血管的新生和MT1-MMP的表達(dá)，探討ADSCs移植對(duì)缺血性卒中后MT1-MMP相關(guān)性血管新生的影響。

1 材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組健康雄性清潔級(jí)大鼠，每只質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自上海斯賴克公司，許可證號(hào)：SCXK滬2007-0005)。大鼠隨機(jī)分為3組，其中假手術(shù)組5只大鼠，MCAO組及ADSCs組各15只大鼠；各組按術(shù)后4 d、7 d、14 d不同時(shí)間點(diǎn)再分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只。

1．2大鼠MCAO模型制備制備MCAO大鼠模型參考改良Zea-Longa線栓法[14]，方法如下：將大鼠麻醉并固定于手術(shù)臺(tái)上，取頸部正中切口，逐步將右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)分離，先后在ECA和CCA近心端結(jié)扎，并于CCA近分叉處剪手術(shù)切口，插入線栓深度約18 mm，阻斷大腦中動(dòng)脈的所有血液來(lái)源，扎緊備線，最后縫合皮膚切口。以同樣方法處理假手術(shù)組大鼠，但是不插入線栓。

1．3脂肪來(lái)源干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化與鑒定取健康清潔級(jí)的體質(zhì)量為80～100 g的雄性SD大鼠，ADSC的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和傳代，用第3代經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)，鑒定證實(shí)為ADSC的細(xì)胞用于移植實(shí)驗(yàn)。

1．4神經(jīng)功能缺損評(píng)分造模后第4、7、14天，采用mNSS量表對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)詁。mNSS評(píng)分包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡4部分，總分為0～18分，分值越大，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1．5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠FⅧ-R Ag標(biāo)記陽(yáng)性血管內(nèi)皮細(xì)胞各組大鼠腦組織常規(guī)石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。先后滴加RAG-1 Antiody (工作濃度約1：300)，兔抗人MT1-MMP抗體(工作濃度1：250)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日標(biāo)本復(fù)溫后，經(jīng)清洗3次后，再先后滴加熒光二抗FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)，Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)；避光孵育1 h，室溫顯色，然后封片、鏡檢。

1．6 Western Blot檢測(cè)蛋白濃度按蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書提取各組大鼠腦組織蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入一抗：兔抗人MT1-MMP抗體(工作濃度1：500)，β-Actin(工作濃度約1：500)，加入二抗：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(工作濃度1：2 000)，山羊抗小鼠IgG(H+L)(工作濃度1：3 000)重復(fù)洗滌3次后；ECL液顯色，成像。Image J軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2．1大鼠神經(jīng)功能mNSS評(píng)分造模4 d后，ADSCs組mNSS評(píng)分與MCAO組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后7 d、14 d，ADSCs組mNSS評(píng)分優(yōu)于同期MCAO組(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠神經(jīng)功能mNSS評(píng)分結(jié)果分)Table 1 Results of mNSS score of nerve function in

2．2大鼠缺血周邊區(qū)新生血管密度(MVD)分析激光共聚焦顯微鏡顯示，腦缺血大鼠梗死周邊區(qū)散在分布FⅧ-R Ag標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖1)，術(shù)后4 d，MCAO組腦缺血大鼠梗死周邊區(qū)可見微血管新生，于術(shù)后7 d、14 d達(dá)高峰；而在相應(yīng)的各時(shí)間點(diǎn)，ADSCs組較MCAO組微血管新生現(xiàn)象更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖1 ADSCs移植后4 d、7 d、14 d，MCAO大鼠腦缺血周邊區(qū)可見大量FⅧ-R Ag標(biāo)記陽(yáng)性血管(標(biāo)尺=100 μm)Figure 1 4 d，7 d and 14 d after ADSCs transplantation，a large number of ADSCs can be seen in the peripheral area of cerebral ischemia in MCAO rats FⅧ-R Ag markers positive blood vessels(ruler =100 μm)

表2 各組腦組織中缺血周邊區(qū)MVD分析Table 2 MVD analysis of peripheral ischemia in brain tissue of each

2．3大鼠腦缺血周邊區(qū)MT1-MMP的蛋白表達(dá)假手術(shù)組中MT1-MMP均呈低水平表達(dá)。MCAO組術(shù)后4 d可見MT1-MMP表達(dá)水平升高，術(shù)后7 d表達(dá)水平達(dá)高峰，而14 d時(shí)表達(dá)水平有所下降。ADSCs組中，MT1-MMP表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)有同樣的趨勢(shì)；移植術(shù)后4 d、7 d，MCAO組MT1-MMP表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表3。移植術(shù)后14 d，2組表達(dá)水平無(wú)顯著差異。此外可見缺血區(qū)MT1-MMP的蛋白表達(dá)變化。見圖3。通過(guò)雙重?zé)晒饷庖呓M化標(biāo)記，在腦缺血大鼠梗死周邊區(qū)，在新生的微血管內(nèi)皮細(xì)胞上可見MT1-MMP及Ⅷ因子共表達(dá)(圖4)。

3 討論

ADSCs是ZUK等[15]于2001年首次從人的脂肪組織中抽取而后懸液中分離獲得，相對(duì)于其他干細(xì)胞，具有易于取材、分離容易、能逃避免疫排斥反應(yīng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，脂肪來(lái)源干細(xì)胞已成為極具前景的種子細(xì)胞之一[16-19]。研究表明[20]，脂肪干細(xì)胞能促進(jìn)缺血性卒中大鼠梗死區(qū)血管新生。其中的機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)VEGF和bFGF的表達(dá)[21]，促進(jìn)血管新生；也可以通過(guò)Notch1-Dll4信號(hào)通路，提高Notch1受體及Dll4配體在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)，促進(jìn)微血管生成，從而起到對(duì)腦缺血大鼠的腦保護(hù)作用。

表3 各組中缺血腦組織周邊區(qū)MT1-MMP的蛋白表達(dá)Table 3 Protein expression of mt1-mmp in peripheral areas of ischemic brain tissue in each

圖2 各組中MT1-MMP的蛋白表達(dá)Figure 2 Protein expression of MT1-MMP in each group

圖3 ADSCs移植后4 d、7 d、14 d MT1-MMP在大鼠腦部的表達(dá)Figure 3 Expression of MT1-MMP in the brain of rats 4 d，7 d and 14 d after ADSCs transplantation

圖4 MT1-MMP與FⅧ-R Ag標(biāo)記新生血管共表達(dá)在微血管內(nèi)皮細(xì)胞上Figure 4 MT1-MMP and FⅧ-R Ag marked the co-expression of neovascularization in microvascular endothelial cells

MT1MMP在血管損傷時(shí)，負(fù)責(zé)降解內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)，參與內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙及歸巢等[22-25]，并重塑血管內(nèi)皮細(xì)胞[26-28]。通過(guò)細(xì)胞間環(huán)境的修飾，MT1-MMP可以使血管內(nèi)皮細(xì)胞或黏附分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生改變，從而影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能，繼而促進(jìn)血管新生[29-32]。相關(guān)研究表明，MT1-MMP基因沉默動(dòng)物模型可見到血管新生抑制現(xiàn)象[33-34]，提示MT1-MMP對(duì)血管新生的影響。而ADSCs移植是否通過(guò)調(diào)節(jié)MT1-MMP促進(jìn)腦血管新生，目前研究較少。許多研究證實(shí)，F(xiàn)Ⅷ-RAg是直接反映血管新生的指標(biāo)，其標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性和敏感性均很強(qiáng)；通過(guò)MT1-MMP與FⅧ-RAg的共同標(biāo)記，可證明MT1-MMP對(duì)血管新生的影響。

本次試驗(yàn)成功建立了MCAO大鼠模型，并移植ADSCs。相比MCAO組及ADSCs組，造模后4d，神經(jīng)功能康復(fù)比較無(wú)明顯差異；在7d、14d，ADSCs組較MCAO組神經(jīng)功能康復(fù)明顯改善。大鼠腦缺血周邊區(qū)域，我們觀察到ADSCs組腦缺血周邊區(qū)微血管新生，且較MCAO組顯著增多，證實(shí)ADSCs移植確能促進(jìn)血管新生；在雙重免疫熒光標(biāo)記后，我們發(fā)現(xiàn)在腦缺血大鼠梗死區(qū)新生內(nèi)皮細(xì)胞上FⅧ-RAg與MT1-MMP共表達(dá)，提示MT1-MMP參與了大鼠腦缺血后梗死周邊區(qū)血管新生。通過(guò)Western-blot印跡分析，在術(shù)后4d，MCAO組可見MT1-MMP表達(dá)升高，術(shù)后7d達(dá)到高峰；而ADSCs組較MCAO組MT1-MMP表達(dá)水平明顯升高；提示ADSCs移植可促進(jìn)大鼠梗死周邊區(qū)MT1-MMP表達(dá)的作用；在術(shù)后14d時(shí)，MT1-MMP表達(dá)水平無(wú)明顯升高，提示MT1-MMP可能在血管新生早期萌芽階段起作用，這與以往的研究結(jié)果相符合[35-38]。因而考慮ADSCs移植的腦保護(hù)作用可能部分是通過(guò)MT1-MMP的表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)血管新生，特別在早期血管新生階段，最終保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)。

ADSCs移植后能夠促進(jìn)MT1-MMP在腦缺血大鼠梗死周邊區(qū)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)，從而促進(jìn)血管新生，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，最終達(dá)到神經(jīng)功能康復(fù)。