李 玲 馮學(xué)超 趙凌俠,2*

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院番茄聯(lián)合研究中心，上海 200240； 2.上海交通大學(xué)植物生物技術(shù)研究中心，上海 200240)

番茄(Solanumlycopersicum)是全球第一大經(jīng)濟(jì)作物[1]，2014年全球產(chǎn)量1.71×1011kg,產(chǎn)值US$ 9.25×1010；我國番茄產(chǎn)量(5.27×1011kg)約占全球1/3(http://www.fao.org/faostat/en/#data/QV/metadata)，在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和蔬菜供給中占有不可或缺地位。同時(shí)，番茄還是植物特別是漿果類遺傳、進(jìn)化、生殖生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的模式植物[2～7]。經(jīng)過半個(gè)多世紀(jì)努力，番茄育種家已培育出數(shù)以千計(jì)的番茄品種，對(duì)番茄產(chǎn)量、抗病性及貨架期改良取得了長足發(fā)展[8～9]。不過，現(xiàn)有番茄特別鮮食番茄已很難滿人們?nèi)找嬖鲩L對(duì)高品質(zhì)番茄的要求，給番茄育種家和科學(xué)工作者提出了新課題；而番茄品質(zhì)改良的關(guān)鍵限制因素是種質(zhì)資源匱乏和基礎(chǔ)理論研究薄弱[8]。

番茄果色和硬度是與品質(zhì)密切相關(guān)的重要經(jīng)濟(jì)性狀，而目前對(duì)番茄果色和硬度形成分子機(jī)制還知之甚少。作者實(shí)驗(yàn)室在解析番茄果色形成機(jī)制時(shí)，用番茄yft1突變體圖位克隆了控制番茄果色形成YFT1基因[10]；同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)YFT1也調(diào)控果實(shí)硬度的形成?；诖耍狙芯恐饕容^分析了yft1與野生型(cv.M82)番茄在果色、硬度和解剖結(jié)構(gòu)隨果實(shí)生育的變化；以期為后續(xù)深入解析YFT1調(diào)控番茄果色和硬度發(fā)育分子機(jī)制和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，特別是對(duì)番茄果色和硬度精準(zhǔn)改良提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 植物材料

番茄種子(cv.M82和yft1)由以色列希伯來大學(xué)Dani Zamir教授提供(http://zamir.sgn.cornell.edu/mutateds)；種子催芽并露白后播種于深圳山智公司生產(chǎn)的60孔育苗盤(裝有濕潤育苗土)中，在26/20℃(光/暗)條件下發(fā)芽和育苗。待4片真葉展開時(shí)，將小苗移栽植于標(biāo)準(zhǔn)聚碳酸酯日光溫室中生長(上海交通大學(xué)，浦江綠谷農(nóng)場(chǎng)，上海市閔行區(qū)浦江鎮(zhèn))，田間管理與普通番茄同。

1.2 番茄果色和硬度檢測(cè)

分別在35、47和54 dpa時(shí)取樣，所選定的取樣時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)于cv.M82的綠熟期(Mature Green，MG),轉(zhuǎn)色期(Breaker，BR)和紅熟期(Red Ripe，RR)。cv.M82和yft1果實(shí)硬度用質(zhì)構(gòu)儀(Model TA.XT Plus,SMSTA,UK)帶直徑6 mm柱形塞(Model SMS P/5)進(jìn)行分析。用0.3牛頓(newton，N)的起始?jí)毫Σ⒁?00 mm·min-1速度壓入11 mm,硬度值取每次測(cè)量最大值。每個(gè)番茄果實(shí)進(jìn)行5點(diǎn)——果蒂、果頂和赤道面3點(diǎn)(1點(diǎn)/120°)測(cè)定，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；并觀察并記錄不同發(fā)育期的番茄果色。

1.3 番茄果皮顯微結(jié)構(gòu)

分別在35,47和54 dpa取cv.M82和yft1果皮，切成1～2 mm小塊，迅速浸入FAA(Formalin-Acetic Acid，100 mL FAA中含有5 mL 37%甲醛,5 mL冰醋酸,63 mL無水乙醇和27 mL去離子水)固定液中。抽真空更換新鮮FAA，4℃貯存?zhèn)溆?。隨后，固定番茄果皮樣品用濃度梯度乙醇(70%,80%和95%)依次脫水30 min，最后100%乙醇脫水2 h。脫水番茄果皮樣品浸入無水乙醇和Technovit 7100樹脂試劑盒(Kulzer and Co,Wehrheim,Germany)Basic Liquid配制預(yù)滲透液(v∶v=1∶1)中2 h，隨后轉(zhuǎn)入滲透液(將Technovit 7100試劑盒的1 g hardener Ⅰ粉末溶于100 mL Basic Liquid)中過夜。滲透處理后的番茄果皮樣品進(jìn)行包埋(包埋劑：1 mL hardener Ⅱ溶于15 mL滲透液中)，在60℃恒溫箱中烘干48 h。用切片機(jī)(LEICA RM2265)將樣品切成2～3 μm薄片，用甲苯胺藍(lán)(Toluidine Blue O，TBO)染色，在顯微鏡(Nikon Eclipse 80i,USA)下觀察并拍照。

2 結(jié)果分析

2.1 番茄果色和果實(shí)硬度隨果實(shí)發(fā)育的變化

在35 dpa時(shí)，野生型cv.M82和突變體yellowfruittomato1(yft1)果實(shí)均處于綠熟期(MG)，果色為綠色，二者間未發(fā)現(xiàn)差異。在47和54 dpa時(shí)，cv.M82果實(shí)分別進(jìn)入了轉(zhuǎn)色期(BR)和紅熟期(RR)，果色分別為橙黃/淺紅和紅色，而yft1的果色與35 dpa時(shí)的無明顯差異，仍處于綠熟期狀態(tài)(圖1)。說明YFT1突變致使番茄果色發(fā)育延遲。

質(zhì)構(gòu)儀檢測(cè)果實(shí)硬度結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在cv.M82和yft1中均表現(xiàn)出果蒂處硬度(36.93±3.12N)比果頂(31.03±4.99N)和赤道面(29.79±1.68N)的大；而果頂與赤道面間的果實(shí)硬度差異不明顯(表1)。cv.M82番茄硬度隨果實(shí)發(fā)育迅速下降，紅熟期(RR)54 dpa果實(shí)硬度(13.68±1.78N)僅相當(dāng)于綠熟期(MG)35 dpa(35.51±1.09N)的1/3。而yft1番茄硬度隨果實(shí)發(fā)育(35～47 dpa)變化不明顯(表1)。

在35 dpa，cv.M82與yft1果實(shí)硬度無顯著差異；而進(jìn)入轉(zhuǎn)色期(47 dpa)后，cv.M82番茄硬度迅速下降，顯著低于yft1的，在紅熟期(54 dpa)，cv.M82番茄硬度(13.68±1.78N)僅相當(dāng)于yft1(33.79±3.28N)的40%(表1)。該結(jié)果暗示YFT1不僅與番茄果色發(fā)育有關(guān)，還參與番茄果實(shí)硬度形成這一重要的生理過程。

圖1 野生型cv.M82和突變體yft1果色隨發(fā)育的變化Fig.1 Alteration of fruit colors with development stages in wild type of cv.M82 and yft1

發(fā)育期Development stagesM82yft1e果蒂Pedicelf果頂Fruit topg赤道面Equatorial plane果蒂Pedicel果頂Fruit top赤道面Equatorial planeh35dpa43.33±1.94Aa36.16±4.88Aa35.51±1.09A44.79±2.81a35.93±4.49a35.92±0.79a47dpa29.30±3.05Bb23.77±4.27Bb26.17±1.34B40.23±0.92a**35.34±5.63a**33.60±1.77a**54dpa21.06±5.96Bc16.42±1.82Bb13.68±1.78C42.85±4.05a**38.56±8.90a**33.79±3.28a**

Note:A,B,C and a,b,c indicate that statistically significance differences of the tomato firmness(on the identical regions of both cv.M82 oryft1) existed between developmental stages atP<0.01 andP<0.05 levels, respectively;**indicate the statistically significance differences of the tomato firmness existed between cv.M82 andyft1 atP<0.01 level(the same regions and developmental stages);e,fthe value was an mean value derived from three biological replicates(mean ± Standard Deviation);gthe value was an calculated average value the total of 9 measured values derived from three biological replicates(mean±SD);hdpa,days post anthesis

2.2 番茄果皮解剖結(jié)構(gòu)分析

為了深入理解YFT1參與調(diào)控番茄果實(shí)硬度形成機(jī)制，本研究通過半薄切片觀察了cv.M82和yft1果皮顯微結(jié)構(gòu)，分析了YFT1對(duì)番茄果皮微結(jié)構(gòu)形成和不同組織細(xì)胞發(fā)育的影響。結(jié)果表明，YFT1突變影響了番茄果皮的微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞大小和形狀。cv.M82果皮中間層的薄壁組織細(xì)胞比靠近外果皮和內(nèi)果皮的大。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，靠近果皮薄壁細(xì)胞伴隨果實(shí)發(fā)育而增大(起始于47 dpa的BR)，由內(nèi)向外；在54 dpa(RR)時(shí)，中果皮和外果皮的薄壁細(xì)胞也變大。并且隨著果實(shí)發(fā)育內(nèi)果皮最初的圓形薄壁細(xì)胞(35 dpa)變成卵圓形(47 dpa)和不規(guī)則形(54 dpa)，甚至在54 dpa時(shí)靠近內(nèi)果皮薄壁細(xì)胞因內(nèi)陷而呈現(xiàn)出不規(guī)則形，細(xì)胞間隙消失(圖2:M82)。與cv.M82相比，yft1果皮細(xì)胞大小和形狀隨果實(shí)發(fā)育變化不明顯，甚至在果實(shí)發(fā)育后期54 dpa，內(nèi)果皮的薄壁細(xì)胞間隙仍清晰可見，這可能與yft1果皮在發(fā)育過程中始終保持較高細(xì)胞膨壓、細(xì)胞間粘合性下降和構(gòu)成細(xì)胞壁多糖降解滯后有關(guān)(圖2:yft1)。

圖2 番茄cv.M82和yft1果皮細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)隨果實(shí)發(fā)育的變化Fig.2 Alteration of pericarp microstructure in cv.M82 and yft1

3 討論

番茄(S.lycopersicum)是全球第一大經(jīng)濟(jì)作物，其品質(zhì)決定了番茄的消費(fèi)習(xí)慣、生產(chǎn)規(guī)模和發(fā)展?jié)摿?，而番茄外觀、口感、風(fēng)味、營養(yǎng)組分和功能物質(zhì)含量與品質(zhì)密切相關(guān)[1,8,11]。果色不僅是番茄果實(shí)發(fā)育進(jìn)程標(biāo)志，決定番茄果色的類胡蘿卜素、花青素和葉綠素等重要抗氧化性物質(zhì)與人類健康密切相關(guān)[11～12]；而果實(shí)硬度取決于果皮細(xì)胞壁多糖沉積水平和細(xì)胞膨壓大小[9,13～14]。我們?cè)谘芯糠褃ft1突變體時(shí)發(fā)現(xiàn)，源自cv.M82的yft1突變體致使果色由紅變黃，并通過遺傳分析確認(rèn)了其單隱性遺傳機(jī)制；通過對(duì)源自cv.M82和yft1的YFT1分析發(fā)現(xiàn)，yft1是由于YFT1的5′UTR遺傳損傷所致。YFT1基因突變致使表達(dá)明顯下降，并使乙烯合成和類胡蘿卜素含量下降和葉綠體發(fā)育延遲[10]。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)YFT1突變也影響到番茄硬度和發(fā)育進(jìn)程。觀察cv.M82和yft1果皮顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在54 dpa時(shí)，野生型cv.M82果皮細(xì)胞或許是由于細(xì)胞壁多糖(纖維素、半纖維素和果膠)沉積、細(xì)胞張力改變，細(xì)胞間相互擠壓呈現(xiàn)出不規(guī)則細(xì)胞和細(xì)胞間隙的消失表型(圖2:M82)。不過，YFT1是通過何種途徑、如何調(diào)控多糖在番茄果皮細(xì)壁上沉積和細(xì)胞膨壓還未見研究報(bào)道。特別是隨著番茄分子生物學(xué)研究進(jìn)展和組學(xué)數(shù)據(jù)增加[1,7]，計(jì)算生物學(xué)應(yīng)用構(gòu)建細(xì)胞壁形成(多糖沉積、組裝、解聚和基因、轉(zhuǎn)錄和蛋白水平調(diào)控)和細(xì)胞膨壓的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將對(duì)后續(xù)番茄品質(zhì)精準(zhǔn)和靶向改良提供理論依據(jù)。而本研究從表型(硬度和顯微結(jié)構(gòu))證實(shí)了YFT1通過延遲番茄發(fā)育而控制番茄果色和硬度形成，將為后續(xù)番茄果色和硬度形成分子機(jī)制的揭示提供了必要表型證據(jù)。

致謝我們感謝以色列希伯來大學(xué)的Dani Zamir教授提供了寶貴的番茄研究材料cv.M82和yft1(n3122)；感謝上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院李云飛教授在番茄硬度測(cè)量給予的幫助，并對(duì)上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院的許杰博士在番茄果皮半薄切片制備、果皮顯微結(jié)構(gòu)觀察給予的指導(dǎo)和幫助表示感謝！