孫 泓 趙興堂,2 劉 璋 楊 凱 王 穎 詹亞光,2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

TOR(target of rapamycin)是真核生物中高度保守的一種大分子的Ser/Thr激酶，通過(guò)磷酸化反應(yīng)激活或抑制下游蛋白激酶(如4E-BPI、S6K、eEF2等)活性，TOR調(diào)節(jié)著核糖體發(fā)生等與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的生理過(guò)程，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖等[1]。核糖體S6蛋白激酶(S6K)屬于是cAMP-CGMP依賴(lài)性激酶和PKC激酶超家族成員之一，是mTOR和PI3K信號(hào)途徑的關(guān)鍵參與者，哺乳動(dòng)物的S6K分為S6K1和S6K2兩類(lèi)[2]。S6K基因具有調(diào)節(jié)細(xì)胞大小、生長(zhǎng)和能量代謝的功能，因該基因失調(diào)而導(dǎo)致的信號(hào)傳導(dǎo)可引起多種人類(lèi)疾病，如癌癥和糖尿病等。

迄今為止，關(guān)于TOR-S6K信號(hào)通路及其影響因素在酵母、動(dòng)物(尤其是哺乳動(dòng)物)中受到廣泛關(guān)注，并獲得大量的研究成果[3]。相對(duì)于動(dòng)物而言，人們對(duì)于植物中TOR-S6K信號(hào)通路知之甚少[4～5]。目前，關(guān)于植物中TOR-S6K信號(hào)通路的研究主要集中于擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6～12]和玉米(Zeamays)[13～16]兩種植物，其他植物如水稻(Oryzasativa)[17]、棉花(Gossypiumhirsutum)[18]中TOR-S6K信號(hào)通路的研究也有涉及。研究表明，TOR在高等植物的胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖等生理過(guò)程中扮演著重要角色[5,7,13～14]，不同植物的TOR調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的機(jī)制可能存在一定的差異[19]。TOR通過(guò)調(diào)節(jié)S6K活性實(shí)現(xiàn)其對(duì)植物細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等過(guò)程的調(diào)節(jié)[7]。

植物細(xì)胞中的S6K也包括S6K1和S6K2，二者具有高度相似的序列和功能[8]。研究表明，多種環(huán)境因素能夠影響S6K基因的表達(dá)，如養(yǎng)分、鹽分、溫度、滲透壓[20]以及氧氣供給狀況、熱激、單線態(tài)氧氣(singlet oxygen)等[21]。葡萄糖缺乏時(shí)S6K通過(guò)抑制細(xì)胞增殖保證細(xì)胞生長(zhǎng)[8]，在鹽脅迫和低溫脅迫下S6K1和S6K2的基因表達(dá)得到加強(qiáng)[22]，滲透壓通過(guò)抑制TOR激酶活性而導(dǎo)致擬南芥中S6K1活性的降低[7]，單線態(tài)氧氣通過(guò)對(duì)某些激酶活性的影響從而影響S6K活性[21]。除環(huán)境因素外，植物激素或植物體內(nèi)某些特定組分也能夠影響S6K的活性[3,6,10,23]。如生長(zhǎng)素能夠活化TOR激酶、加速S6K1的磷酸化[23]，胰島素或類(lèi)胰島素類(lèi)(如玉米ZmIGF)的生長(zhǎng)因子能夠誘導(dǎo)S6K的磷酸化[3]；植物體內(nèi)Tap46(PP2A的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基)的表達(dá)水平也能夠影響S6K的磷酸化[10]。盡管目前在草本植物中已有關(guān)于S6K的相關(guān)研究[6～18]，但針對(duì)木本植物的S6K基因鮮見(jiàn)報(bào)道。

水曲柳(Fraxinusmandshurica)系木樨科(Oleaceae)梣屬(Fraxinus)喬木。作為材質(zhì)優(yōu)良和瀕危樹(shù)種，水曲柳受到研究者的很大關(guān)注[24～26]。本文以我們克隆獲得的水曲柳S6K基因(命名為FmS6K)為對(duì)象，在研究該基因基本特征的基礎(chǔ)上，探討低溫(4℃)、鹽(NaCl)等非生物脅迫以及脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)和IAA(吲哚乙酸)處理對(duì)基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討該基因在水曲柳代謝調(diào)控功能方面的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理設(shè)置

實(shí)驗(yàn)所用的水曲柳種子取自東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，將種子萌發(fā)所形成的水曲柳幼苗置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基質(zhì)為V(營(yíng)養(yǎng)土)∶V(蛭石)=3∶1，并調(diào)整培養(yǎng)箱維持溫度23±2℃以及濕度60%～80%，日照16 h，保證植物正常生長(zhǎng)[24]。待水曲柳幼苗培養(yǎng)至15 d時(shí)，取長(zhǎng)勢(shì)均一的植株分別用低溫(4℃)、NaCl(200 mmol·L-1)、ABA(脫落酸，100 μmol·L-1)、GA(赤霉素，100 μmol·L-1)和IAA(吲哚乙酸，100 μmol·L-1)處理。鹽處理使用澆灌，激素處理使用葉面噴施，對(duì)照組不做任何處理，然后在正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別于處理后1、3、6、12、24和48 h取樣，各3次重復(fù)。樣品于-80℃冰箱保存。

1.2 氨基酸序列理化性質(zhì)分析

利用軟件Protparam分析FmS6K1及FmS6K2氨基酸序列的理化性質(zhì)；利用軟件ProtScale的Kyte and Doolittle算法分析FmS6K1及FmS6K2蛋白親水/疏水性；再利用在線分析工具Signa-P的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對(duì)FmS6K1及FmS6K2蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，并分析FmS6K1及FmS6K2蛋白的信號(hào)肽；利用在線工具TMPred預(yù)測(cè)和分析FmS6K1及FmS6K2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；應(yīng)用GOR4和SMART預(yù)測(cè)FmS6K1及FmS6K2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)域。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)FmS6K1及FmS6K2基因序列以及推測(cè)的編碼蛋白進(jìn)行同源序列比對(duì)；應(yīng)用PRALINE在線多序列比對(duì)軟件分析對(duì)FmS6K1及FmS6K2推測(cè)的編碼蛋白以及上述物種中的同源蛋白，進(jìn)行同源序列比對(duì)分析。利用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[27～28]。表1為克隆FmS6K基因編碼區(qū)所用的對(duì)應(yīng)引物，所獲得的核苷酸序列已提交GenBank(所獲得的FmS6K1及FmS6K2基因登錄號(hào)分別為MG269832和MG269833)。

表1克隆FmS6K基因編碼區(qū)對(duì)應(yīng)引物

Table1PrimersusedforcloningthecodingregionsinFmS6Kgene

引物名稱(chēng)Primer name引物序列Primer sequenceFmS6K1-F5'-CAGGAGTGTTCGATAATTGGTCA-3'FmS6K1-R5'-AGGGACTATCATAAACTATTCGAAA-3'FmS6K2-F5'-ACCAACCCCTCTTTTCGGCAC-3'FmS6K2-R5'-TGTCAAACTTCAGGGACCACTCT-3'

1.3 RNA提取與FmS6K基因的擴(kuò)增

應(yīng)用CTAB法提取水曲柳RNA[25]。瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)表明(圖1)提取的總RNA質(zhì)量較好，條帶清晰、穩(wěn)定，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行RT-PCR，產(chǎn)物長(zhǎng)度在150～250 bp，模板為稀釋30倍的cDNA。熒光定量使用Takara(SYBR Green)試劑盒，PCR體系(20 μL)：滅菌蒸餾水6.8 μL，SYBR Premix EXTaq10 μL，上下游引物各0.4 μL，50×ROX reference dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA模板2 μL。利用Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃、30 s→95℃、5 s→60℃、34 s(共40個(gè)循環(huán))→95℃、15 s→60℃、1 min→95℃、15 s。每份樣品重復(fù)3次[29]。以水曲柳a-Tubulin基因作為內(nèi)參[30]，計(jì)算FmS6K1及FmS6K2基因的相對(duì)表達(dá)水平2-ΔΔCT。其中：

ΔΔCT=(CT靶基因-CT內(nèi)參)處理組-(CT靶基因-CT內(nèi)參)對(duì)照組

(1)

表2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 采用的引物序列

圖1 總RNA質(zhì)量的凝膠電泳檢測(cè)Fig.1 Electrophoresis detection of total RNA

2 結(jié)果與分析

2.1 FmS6K氨基酸序列理化性質(zhì)分析

本研究中，克隆得到的水曲柳S6K的兩個(gè)基因，分別命名為FmS6K1及FmS6K2。水曲柳FmS6K1基因全長(zhǎng)1 583 bp，編碼480個(gè)氨基酸，含有完整的開(kāi)放閱讀碼框。FmS6K1蛋白的等電點(diǎn)(PI)為6.04、不穩(wěn)定系數(shù)為43.65，為不穩(wěn)定的蛋白；FmS6K1蛋白共有26個(gè)疏水區(qū)、38個(gè)親水區(qū)域，總平均疏水指數(shù)為-0.344，說(shuō)明該蛋白為兩性蛋白。

水曲柳FmS6K2基因全長(zhǎng)1 796 bp，編碼483個(gè)氨基酸。與FmS6K1一樣，F(xiàn)mS6K2蛋白也含有完整的開(kāi)放閱讀碼框。其等電點(diǎn)(PI)為8.14、不穩(wěn)定系數(shù)為42.73，為不穩(wěn)定的蛋白；FmS6K2蛋白的總平均疏水指數(shù)為-0.547，表明該蛋白為親水蛋白。

2.2 信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析

信號(hào)肽是N端的一段氨基酸序列，一般由16～26個(gè)氨基酸殘基組成，指導(dǎo)分泌性蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上合成，在蛋白質(zhì)合成結(jié)束之前被切除，其中包括疏水核心區(qū)、信號(hào)肽的C端和N端。本研究中，F(xiàn)mS6K1及FmS6K2均不存在信號(hào)肽(圖2)。

跨膜結(jié)構(gòu)是一段氨基酸片段，一般由20個(gè)左右的疏水性氨基酸殘基組成，主要形成α-螺旋。利用在線工具TMPred對(duì)FmS6K1蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，F(xiàn)mS6K1蛋白可能存在一個(gè)顯著的跨膜螺旋，其跨膜螺旋可能位于第328個(gè)氨基酸(亮氨酸)和第349個(gè)氨基酸(丙氨酸)之間，共包括22個(gè)氨基酸，如果N末端定為外側(cè)(o)，C末端為內(nèi)側(cè)(i)，則這個(gè)跨膜螺旋的方向?yàn)閛→I。上述結(jié)果表明FmS6K1蛋白具有跨膜能力，其方向是從外到內(nèi)的。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，F(xiàn)mS6K2蛋白理論上不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖3)。

圖2 FmS6K1和FmS6K2蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和分析Fig.2 Prediction and analysis of signal peptides in FmS6K1 and FmS6K2 proteins

圖3 FmS6K1和FmS6K2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和分析Fig.3 Prediction and analysis of trans-membrane domain in FmS6K1 and FmS6K2 proteins

2.3 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)與分析

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)，二級(jí)結(jié)構(gòu)是指α螺旋和β折疊等規(guī)則的蛋白質(zhì)局部結(jié)構(gòu)元件，不同的氨基酸殘基對(duì)于形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件具有不同的傾向性。由軟件分析得到FmS6K1蛋白是由31.67%的α螺旋(Alpha helix)、14.37%的延伸鏈(Extanded strand)和53.96%的無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)所組成的，并且分布于整個(gè)蛋白。由此可知，F(xiàn)mS6K1蛋白較不穩(wěn)定，為不穩(wěn)定蛋白。而FmS6K2蛋白是由26.92%的α螺旋、18.84%的延伸鏈和54.24%的無(wú)規(guī)則卷曲所組成的，這些結(jié)構(gòu)分布于整個(gè)蛋白，且FmS6K2蛋白同樣為不穩(wěn)定蛋白。FmS6K1蛋白含有一個(gè)S_TKc(151～407位氨基酸)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)S_TK_X結(jié)構(gòu)域(408～467位氨基酸)，而FmS6K2蛋白含有一個(gè)低復(fù)雜性的結(jié)構(gòu)域(53～63位氨基酸)、一個(gè)S_TKc(154～415位氨基酸)結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)S_TK_X(416～475位氨基酸)結(jié)構(gòu)域(圖4)。

圖4 FmS6K1(A)和FmS6K2(B)所含結(jié)構(gòu)域Fig.4 The domains contained in FmS6K1(A) and FmS6K2(B)

2.4 氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)是物種的進(jìn)化史，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以描述物種之間的進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)化樹(shù)標(biāo)尺表示相對(duì)遺傳距離的多少。圖5A為FmS6K1氨基酸序列與24種相近物種進(jìn)行同源序列比對(duì)后所構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，所獲得的FmS6K1蛋白序列，與芝麻(Sesamumindicum，胡麻科)、水稻(Oryzasativa，禾本科)、Dichantheliumoligosanthes(禾本科)、高粱(Sorghumbicolor，禾本科)、無(wú)油樟(Amborellatrichopoda，無(wú)油樟科)、菠蘿(Ananascomosus，鳳梨科)、可可(Theobromacacao，梧桐科)等關(guān)系較遠(yuǎn)。FmS6K1蛋白雖然與Prunuspersica(薔薇科)、Prunusavium(薔薇科)、木薯(Manihotesculenta，大戟科)、麻風(fēng)樹(shù)(Jatrophacurcas，大戟科)、橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis，大戟科)、野大豆(Glycinesoja，豆科)、大豆(Glycinemax，豆科)、木豆(Cajanuscajan，豆科)、蔓花生(Arachisduranensis，豆科)、Arachisipaensis(豆科)、截形苜蓿(Medicagotruncatula，豆科)、毛果楊(Populustrichocarpa，楊柳科)、土瓶草(Cephalotusfollicularis，土瓶草科)、桑樹(shù)(Morusnotabilis，?？?、Herraniaumbratica(錦葵科)、馬鈴薯(Solanumtuberosum，茄科)、博落回(Macleayacordata，罌粟科)等物種聚為一支，但水曲柳FmS6K1蛋白與這些物種的關(guān)系也相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖5(B)為FmS6K2氨基酸序列與24種相近物種進(jìn)行同源序列比對(duì)后所構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。所獲得的FmS6K2蛋白序列與無(wú)油樟及小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris，蘭科)關(guān)系較遠(yuǎn)；雖然FmS6K2蛋白序列與Prunuspersica、Prunusavium、桑樹(shù)、麻風(fēng)樹(shù)、木薯、橡膠樹(shù)、榴蓮(Duriozibethinus，木棉科)、Herraniaumbratica、可可、苦瓜(Momordicacharantia，葫蘆科)、博落回、煙草(Nicotianatabacum，茄科)、番茄(Solanumlycopersicum，茄科)、菠菜(Spinaciaoleracea，藜科)、Chenopodiumquinoa(藜科)、蒺藜狀苜蓿(Medicagotruncatula，豆科)、Arachisipaensis、野大豆、木豆、綠豆(Vignaradiata，豆科)等聚成一大類(lèi)，但與芝麻親緣關(guān)系最近。

2.5 S6K基因在水曲柳中的表達(dá)

2.5.1 非生物脅迫下水曲柳中S6K的表達(dá)

非生物脅迫下，水曲柳FmS6K1和FmS6K2基因在根、莖、葉中的表達(dá)水平隨處理時(shí)間和脅迫因子的不同而上下波動(dòng)?？偟膩?lái)說(shuō)，F(xiàn)mS6K1基因在低溫以及鹽處理時(shí)呈現(xiàn)根——莖——葉依次出現(xiàn)表達(dá)最高的特點(diǎn)，而FmS6K2基因?qū)Φ蜏靥幚砗望}處理的相應(yīng)較FmS6K1基因復(fù)雜。

低溫處理時(shí)(圖6)，水曲柳FmS6K1基因在根和莖中的表達(dá)隨著時(shí)間表現(xiàn)為先上升、后下降的變化趨勢(shì)，在處理6 h時(shí)根中FmS6K1基因表達(dá)最高，為處理1 h時(shí)的15.82倍，而莖中FmS6K1基因表達(dá)在12 h時(shí)最高，為處理1 h時(shí)的2.91倍；FmS6K1基因在葉中的表達(dá)總體表現(xiàn)為隨著時(shí)間逐漸上升。鹽(NaCl)處理?xiàng)l件下，F(xiàn)mS6K1基因在水曲柳根中的表達(dá)隨著時(shí)間也表現(xiàn)為先上升、后下降的變化趨勢(shì)，在處理24 h時(shí)根中FmS6K1基因表達(dá)最高，相對(duì)于1 h時(shí)的表達(dá)顯著提高了19.70倍；在莖中FmS6K1基因的表達(dá)總體表現(xiàn)為前期(6 h之前)較低而后期(6 h之后)較高；而FmS6K1基因在葉中的表達(dá)總體表現(xiàn)為隨著時(shí)間逐漸上升。

圖8 ABA對(duì)水曲柳FmS6K1(A)和FmS6K2(B)基因表達(dá)的影響Fig.8 Effect of ABA on the relative expression of FmS6K1(A) and FmS6K2(B) genes in F.mandshurica

比較兩種脅迫條件下FmS6K1基因的表達(dá)，在相同的時(shí)間點(diǎn)鹽脅迫條件下FmS6K1基因的表達(dá)高于低溫脅迫，鹽脅迫時(shí)FmS6K1基因的表達(dá)(48 h的平均值)分別是低溫脅迫的2.82倍(根)、1.42倍(莖)和4.38倍(葉)。上述結(jié)果表明，低溫和鹽分脅迫對(duì)葉中FmS6K1基因表達(dá)的影響是較為一致的，而對(duì)根和莖中FmS6K1基因表達(dá)的影響較為復(fù)雜(尤其是莖)。

低溫處理時(shí)(圖7)，水曲柳根和葉中FmS6K2基因的表達(dá)總體上表現(xiàn)為隨著時(shí)間推移先下降、后上升，6 h時(shí)根和葉中FmS6K2基因的表達(dá)最低，為根處理1 h時(shí)的0.22倍以及葉處理48 h的0.09倍；而莖中FmS6K2基因的表達(dá)表現(xiàn)為2個(gè)“倒V字型”(即2次先上升、后下降過(guò)程，或稱(chēng)“雙峰型”)。相對(duì)于低溫脅迫，鹽脅迫對(duì)水曲柳根莖葉中FmS6K2基因的表達(dá)的影響較為復(fù)雜，根中FmS6K2基因的表達(dá)表現(xiàn)為：下降——升高——下降，莖中FmS6K2基因的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，葉中FmS6K2基因的表達(dá)表現(xiàn)為前期(6 h之前)呈現(xiàn)先上升后下降，后期(6 h后)基本保持穩(wěn)定。

比較兩種脅迫條件下FmS6K2基因的表達(dá)，在48 h培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)鹽脅迫時(shí)FmS6K2基因的表達(dá)(48 h的平均值)分別是低溫脅迫的3.61倍(根)、1.65倍(莖)和2.25倍(葉)。

綜合比較兩個(gè)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是低溫脅迫還是鹽脅迫時(shí)，F(xiàn)mS6K2基因的表達(dá)均高于FmS6K1基因的表達(dá)，表明FmS6K2基因相對(duì)于FmS6K1基因?qū)Φ蜏睾望}脅迫的響應(yīng)更為敏感。我們推測(cè)FmS6K2基因在水曲柳的逆境生長(zhǎng)中可能發(fā)揮著更為重要的作用。

2.5.2 生物激素影響下水曲柳中FmS6K的表達(dá)

植物激素對(duì)FmS6K基因表達(dá)的影響較為復(fù)雜。總體來(lái)說(shuō)，對(duì)于ABA信號(hào)，F(xiàn)mS6K1和FmS6K2基因均呈現(xiàn)根——莖——葉依次出現(xiàn)表達(dá)最高的特點(diǎn)，且FmS6K2基因表達(dá)高于FmS6K1基因；對(duì)于GA信號(hào)，F(xiàn)mS6K1和FmS6K2基因則表現(xiàn)出在根中的表達(dá)略高于莖和葉，且FmS6K2基因表達(dá)高于FmS6K1基因；而對(duì)于IAA信號(hào)，F(xiàn)mS6K1和FmS6K2基因則表現(xiàn)出在莖中的表達(dá)略高于根和葉。

ABA(脫落酸)對(duì)水曲柳根和莖中FmS6K1和FmS6K2基因的影響總體上表現(xiàn)為先上升、再下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)6 h時(shí)根和莖中FmS6K1基因的表達(dá)均達(dá)到最高，分別為根和莖處理1 h時(shí)的1 103.36倍以及27.55倍，根和莖中FmS6K2基因的表達(dá)分別在3和6 h達(dá)到最高，分別為根和莖處理1 h時(shí)的45.03倍以及27.66倍；ABA對(duì)水曲柳根、莖和葉中FmS6K1和FmS6K2基因的表達(dá)總體表現(xiàn)為隨時(shí)間增加而逐步提高(圖8)。相比于FmS6K1基因，F(xiàn)mS6K2基因?qū)BA刺激的響應(yīng)更為顯著，在ABA刺激下，F(xiàn)mS6K2基因在根、莖和葉中的表達(dá)(48 h的平均值)分別是FmS6K1基因的5.37、2.39和2.41倍。

圖9 GA對(duì)水曲柳FmS6K1(A)和FmS6K2(B)基因表達(dá)的影響Fig.9 Effect of GA on the relative expression of FmS6K1(A) and FmS6K2(B) genes in F.mandshurica

圖10 IAA對(duì)水曲柳FmS6K1(A)和FmS6K2(B)基因表達(dá)的影響Fig.10 Effect of IAA on the relative expression of FmS6K1(A) and FmS6K2(B) genes in F.mandshurica

GA(赤霉素)作為植物主要的激素之一，參與植物體內(nèi)多種發(fā)育過(guò)程與代謝產(chǎn)物的調(diào)控。本研究中，GA處理對(duì)水曲柳的根和葉中FmS6K1和FmS6K2基因表達(dá)的影響總體上表現(xiàn)為隨著時(shí)間推移先上升后下降(圖9)，但根和葉中FmS6K1和FmS6K2基因的最大表達(dá)不同步。在GA作用下，根中FmS6K1和FmS6K2基因的表達(dá)在6 h時(shí)最高，分別比GA處理1 h時(shí)的表達(dá)提高了83.91倍以及7.27倍，而葉中FmS6K1和FmS6K2基因的表達(dá)在12 h時(shí)最高，分別比GA處理1 h時(shí)的表達(dá)提高了44.58倍以及50.16倍。與根和葉不同，隨著時(shí)間推移莖中FmS6K1和FmS6K2基因的表達(dá)表現(xiàn)出不同的趨勢(shì)，F(xiàn)mS6K1基因表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，并在6 h達(dá)到最大表達(dá)，為處理1 h時(shí)的15.10倍；而FmS6K2基因則呈現(xiàn)出隨時(shí)間逐漸上升趨勢(shì)，其表達(dá)在48 h時(shí)達(dá)到最大，為處理1 h的4.38倍。在GA作用下，F(xiàn)mS6K2基因的表達(dá)高于FmS6K1基因，F(xiàn)mS6K2基因?qū)A刺激的響應(yīng)更為顯著，F(xiàn)mS6K2基因在根、莖和葉中的表達(dá)(48 h的平均值)分別是FmS6K1基因的5.36、1.82和1.14倍。

IAA(吲哚乙酸)作為一種植物內(nèi)源生長(zhǎng)素，對(duì)植物抽枝或芽、苗等的頂部芽端形成有促進(jìn)作用。IAA對(duì)水曲柳中FmS6K1和FmS6K2基因在根、莖、葉中表達(dá)的影響是不同的(圖10)。本研究中，IAA對(duì)水曲柳根和葉中FmS6K1基因表達(dá)的影響總體表現(xiàn)為2個(gè)“倒V字型”(即2次先上升、后下降過(guò)程，或稱(chēng)“雙峰型”)，盡管水曲柳葉中FmS6K2基因的表達(dá)也呈“雙峰型”)，但根中的FmS6K2基因表達(dá)表現(xiàn)為隨著時(shí)間推移而逐漸增加。在IAA處理?xiàng)l件下，莖中的FmS6K1和FmS6K2基因表達(dá)均表現(xiàn)為“單峰型”，都在12 h時(shí)達(dá)到最高，分別為處理1 h時(shí)的143.86倍以及12.63倍。

不同于ABA和GA，IAA對(duì)FmS6K1和FmS6K2基因表達(dá)的影響主要體現(xiàn)在培養(yǎng)的前3 h。在IAA作用的前3 h內(nèi)，F(xiàn)mS6K2基因表達(dá)高于FmS6K1基因，3 h后二者之間并無(wú)顯著差異，甚至FmS6K2基因表達(dá)低于FmS6K1基因。

綜合比較3種植物激素對(duì)兩個(gè)基因表達(dá)的影響，總體而言IAA處理時(shí)水曲柳根、莖、葉中FmS6K1基因表達(dá)(48 h的平均值)高于ABA和GA。但對(duì)于FmS6K2基因表達(dá)(48 h的平均值)而言，GA和ABA有利于提高根中FmS6K2基因表達(dá)，而IAA和ABA則更有利于水曲柳莖和葉中FmS6K2基因表達(dá)的提高。

3 討論與結(jié)論

3.1 S6K基因及其編碼的蛋白質(zhì)

TOR信號(hào)網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)對(duì)植物十分重要的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)[31]，而S6K(S6K1/S6K2)作為T(mén)OR信號(hào)的效應(yīng)因子，受TOR直接調(diào)控，影響植物性狀的表達(dá)[4]，是該通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因。mTORC1(哺乳動(dòng)物TORC1)磷酸化并激活S6K1和S6K2，其首先識(shí)別的底物是rS6(核糖體蛋白S6，40S核糖體的組分)。過(guò)去十年的研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)S6K1底物，揭示了mTORC1-S6K1軸調(diào)節(jié)細(xì)胞生理的多個(gè)水平。相對(duì)于動(dòng)物，目前對(duì)植物(特別是木本植物)中的S6K基因報(bào)道較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mS6K1和FmS6K2基因長(zhǎng)度分別為1 583和1 796 bp，分別編碼480和483個(gè)氨基酸，二者均含有完整的開(kāi)放閱讀框，這與玉米中ZmS6K基因性質(zhì)相似[32]。在親緣關(guān)系上，F(xiàn)mS6K1氨基酸序列與其他24個(gè)物種關(guān)系均較遠(yuǎn)，而FmS6K2氨基酸序列則與胡麻科的芝麻遺傳距離較近。

3.2 影響水曲柳S6K基因表達(dá)的主要因素

非生物脅迫是限制植物生長(zhǎng)及產(chǎn)量的重要因素。而在非生物脅迫中，鹽與低溫對(duì)植物體均產(chǎn)生很大傷害[33]，帶電的Na+離子能夠使質(zhì)膜去極化，導(dǎo)致K+通過(guò)去極化活化的K+通道向外泄露。這將降低細(xì)胞內(nèi)K+的濃度，損害細(xì)胞的新陳代謝并可能導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。因此，離子平衡的維護(hù)是植物抵御鹽脅迫的一類(lèi)重要機(jī)制[34]。本研究中，低溫和鹽脅迫均促進(jìn)S6K基因的表達(dá)，相對(duì)于低溫脅迫，鹽脅迫更利于水曲柳根、莖、葉中FmS6K1和FmS6K2基因的表達(dá)，而對(duì)FmS6K1和FmS6K2基因而言，后者對(duì)低溫和鹽脅迫的響應(yīng)更為敏感。環(huán)境要素對(duì)其他植物(如擬南芥)體內(nèi)S6K基因表達(dá)的影響在其他研究中也得到證實(shí)[7,20,22]。研究表明，低溫和鹽脅迫條件下擬南芥和玉米體內(nèi)的S6K基因的表達(dá)得到加強(qiáng)[20,22,35]，本研究的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

植物激素在種子萌發(fā)、植物生長(zhǎng)發(fā)育及其抗逆過(guò)程中扮演著重要角色[36～37]。相對(duì)于外界脅迫因素對(duì)S6K基因表達(dá)影響而言，植物激素對(duì)S6K基因表達(dá)的影響研究工作開(kāi)展相對(duì)較少[6,18]。Turck等證實(shí)，植物激素1-NAA(生長(zhǎng)素，auxin)和激動(dòng)素(kinetin)會(huì)影響植物S6K基因的表達(dá)，在這些植物激素存在的情況下S6激酶活性增加[6]。AZD8055是一種TOR抑制劑，能夠有效抑制TOR活性、延緩植物生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸(jasmonic acid)作為一種植物激素能夠緩解AZD8055對(duì)棉花幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，Song等認(rèn)為茉莉酸的這種作用是通過(guò)TOR與茉莉酸的交互作用實(shí)現(xiàn)的[18]。本研究中，IAA、ABA和GA處理有利于提高水曲柳中FmS6K基因的表達(dá)，IAA處理時(shí)水曲柳根、莖、葉中FmS6K1基因表達(dá)(48 h的平均值)高于ABA和GA；GA和ABA有利于提高根中FmS6K2基因表達(dá)(48 h的平均值)，而IAA和ABA則更有利于水曲柳莖和葉中FmS6K2基因表達(dá)的提高。表明S6K基因作為一個(gè)多信號(hào)節(jié)點(diǎn)，IAA、ABA和GA通過(guò)提高水曲柳中FmS6K基因的表達(dá)，平衡水曲柳在正常條件下與逆境條件下的生長(zhǎng)與生存的功能。

水曲柳FmS6K1和FmS6K2基因全長(zhǎng)分別為1 583和1 796 bp，二者分別編碼480和483個(gè)氨基酸；低溫和鹽脅迫可以誘導(dǎo)FmS6K基因的表達(dá)，外源信號(hào)ABA、GA、IAA均能提高FmS6K基因的表達(dá)。本研究初步探討了S6K在木本植物水曲柳中的表達(dá)和生物信息學(xué)特征，為進(jìn)一步研究FmS6K基因響應(yīng)非生物脅迫和信號(hào)誘導(dǎo)奠定了基礎(chǔ)，關(guān)于水曲柳中S6K基因的表達(dá)及其調(diào)控仍有大量研究工作有待開(kāi)展。