狄林楠 李新蓉 宋 楠

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境學(xué)科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

遺傳多樣性作為生物多樣性的重要組成部分，是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ)，是生物物種在長期進(jìn)化過程中積累起來的遺傳變異，是其生存適應(yīng)和進(jìn)化的前提，遺傳多樣性的喪失將對(duì)物種生存帶來不利影響[1～2]。對(duì)珍稀瀕危植物的遺傳多樣性研究不僅有助于了解物種的進(jìn)化歷史和適應(yīng)潛力，同時(shí)對(duì)其保護(hù)和管理也至關(guān)重要[3～4]。近年來，隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，包括ISSR、RAPD等DNA分子標(biāo)記正廣泛地應(yīng)用于珍稀瀕危植物遺傳多樣性的研究[5～7]。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(SCoT,start codon targeted polymorphism)標(biāo)記是Collard和Mackill[8]基于植物基因中的ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性而新開發(fā)的一種目的基因分子標(biāo)記。與ISSR標(biāo)記、RAPD標(biāo)記類似亦為單引物，不同的是SCoT分子標(biāo)記是一種目的基因分子標(biāo)記，其本身可能是目的基因的一部分或與目的基因緊密聯(lián)鎖；另外與RAPD標(biāo)記相比較，其使用了較長的引物長度，理論上比RAPD標(biāo)記重復(fù)性好；同時(shí)還具有引物設(shè)計(jì)簡單、操作簡單、成本低廉和多態(tài)性高等特點(diǎn)[8～10]。目前已成功在評(píng)估遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)、種質(zhì)鑒定與指紋圖譜構(gòu)建等方面得到運(yùn)用[11～14]。

裸果木(Gymnocarposprzewalskii)為石竹科(Caryophyllaceae)裸果木屬(Gymnocarpos)植物，亞灌木，是白堊紀(jì)——第三紀(jì)古老荒漠的殘余成分，是構(gòu)成石質(zhì)荒漠植被重要建群物種之一，對(duì)研究中國西北荒漠的形成、氣候變化以及旱生植物區(qū)系成分的起源有較重要的科學(xué)價(jià)值[15]。裸果木在國內(nèi)僅分布在甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏和新疆等省區(qū)，另有少量分布在蒙古，在新疆主要分布在哈密盆地和塔里木盆地[16～17]。裸果木具兩性花，在盛花期呈現(xiàn)出“集中大量”的開花模式，并有少量花蜜分泌且有濃烈氣味，繁育系統(tǒng)屬于以異交為主、部分自交親和且需要傳粉者的混合繁育系統(tǒng)類型[18～19]。由于裸果木生存條件惡劣，過度樵采和駱駝啃食等人類活動(dòng)的干擾和破壞，其種群處于不斷衰退中[20]。王靜等[21]對(duì)裸果木RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化進(jìn)行了研究，Ma等[22]運(yùn)用葉綠體DNA和徐振朋等[23]用ISSR標(biāo)記對(duì)裸果木種群遺傳多樣性進(jìn)行了研究，但關(guān)于裸果木遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)及其影響因素還有所不足，本文運(yùn)用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)新疆裸果木分布集中的7個(gè)自然種群遺傳多樣性進(jìn)行分析，探討裸果木種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)及其影響因素，為進(jìn)一步保護(hù)和利用裸果木提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 野外調(diào)查和采樣

2015年5月在新疆裸果木分布集中的7個(gè)自然種群采集樣品，材料來源見表1和圖1。選取裸果木頂端幼嫩的葉片放入裝有硅膠的自封袋中干燥，每個(gè)自封袋中硅膠與裸果木嫩葉的比例不小于100∶1，對(duì)每袋樣本分別進(jìn)行標(biāo)記。

表1裸果木自然種群的地理位置和樣本大小

Table1LocationsamplesizeofG.przewalskiipopulations

種群Population經(jīng)度Latitude(E)緯度Longitude(N)海拔Altitude(m)樣本數(shù)Sample number輪臺(tái)Luntai(LT)84°24'41°59'107730烏恰Wuqia(WQ)75°01'39°39'213430拜城Baicheng(BC)81°50'41°52'140839疏附Shufu(SF)75°44'39°19'13526庫車Kuqa(KC)82°41'41°55'146536哈密廟爾溝Hami Miaoergou(HM)93°53'42°52'97830哈密三道嶺Hami Sandaoling(HS)92°33'43°15'132930

圖1 裸果木采樣分布圖Fig.1 Geographic location of G.przewalskii

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取

采用改良CTAB法提取裸果木基因組DNA，所得的DNA用紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND1000型，美國Thermo Scientific公司)和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和質(zhì)量，并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選

SCoT引物參照Collard和Mackill[8]、Luo等人[11]公布的引物序列，由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物篩選過程如下：

(1)初篩：選取供試樣品中7個(gè)種群各一個(gè)樣品所提取的DNA組成混合模板，分別對(duì)80條引物組合進(jìn)行篩選，以期得到適合裸果木遺傳多樣性分析的引物(此次篩選結(jié)果篩選出28條引物)。

(2)復(fù)篩：利用篩選出的引物分別對(duì)個(gè)體進(jìn)行篩選，選出最適合于此樣品的引物。利用最終確定的引物(表2)對(duì)裸果木所有個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表2 SCoT引物信息表

1.2.3 SCoT-PCR擴(kuò)增及檢測

SCoT-PCR反應(yīng)體系：25 μL的反應(yīng)體系中包含有l(wèi) μL模板DNA(50 ng)，1 μL引物(10 μmol·L-1)，0.3 μL Taq DNA聚合酶(2.5 U·μL-1)，0.4 μL dNTPs(10 mmol·L-1)，2.5 μL 10×Taq Buffer(15 mmol·L-1MgCl2)，其余部分由ddH2O補(bǔ)足。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性5 s，退火15 s，72℃延伸50 s反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：擴(kuò)增產(chǎn)物與4 μL上樣緩沖液混合后在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳1 h分離，利用銀染法進(jìn)行染色，照相記錄。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)每條引物擴(kuò)增產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠中遷移率的不同，對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，擴(kuò)增陽性(有條帶出現(xiàn))賦值為1，擴(kuò)增陰性(無條帶出現(xiàn))賦值為0，依據(jù)條帶有無統(tǒng)計(jì)得到所有位點(diǎn)的二元矩陣輸入計(jì)算機(jī)。應(yīng)用Popgene32計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(P)、多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)、觀察等位基因數(shù)(na)、有效等位基因數(shù)(ne)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息多樣性指數(shù)(I)、種群總的基因多樣性(Ht)、種群內(nèi)的基因多樣性(Hs)、遺傳分化系數(shù)(Gst)、Nei的遺傳一致度和遺傳距離，根據(jù)Ht和Hs計(jì)算種群間的基因多樣性和種群內(nèi)遺傳分化所占比例，種群間基因流(Nm)由Nm=(1-Gst)/4Gst計(jì)算。另外運(yùn)用SPSS20.0軟件非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)H和I進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)各種群間遺傳多樣性是否存在差異。

采用STRUCTURE2.3.4軟件分析裸果木的遺傳結(jié)構(gòu)，將參數(shù)“Length of Burnin period”和“Number of MCMC Reps after Burnin”均設(shè)為10 000次，K值設(shè)為2～7，重復(fù)次數(shù)為10。將運(yùn)算結(jié)果提交到在線工具Structure Harvester(http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/)以判斷群體的最佳K值(△K值)，運(yùn)用CLUMPP1.1.2重復(fù)抽樣分析最佳K值，再利用Distruct 1.1軟件作圖。

運(yùn)用NTSYS 2.10e軟件對(duì)裸果木種群遺傳距離和地理距離的相關(guān)性進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)。此外對(duì)201份不同自然種群裸果木材料進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA,principal coordinates analysis)，建立平面散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果

2.1 裸果木種群的遺傳多樣性

12條引物對(duì)7個(gè)種群的201個(gè)個(gè)體共擴(kuò)增出145個(gè)位點(diǎn)，擴(kuò)增得到的DNA片段長度大多介于100～1 500 bp，每條引物擴(kuò)增的位點(diǎn)在10～17個(gè)。由表3可知，裸果木物種水平的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為141個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為97.24%；而種群水平的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)在54～131，多態(tài)位點(diǎn)百分率在37.24%～90.34%，疏附(SF)種群的多態(tài)位點(diǎn)百分率最低為37.24%，而哈密廟爾溝(HM)種群的多態(tài)位點(diǎn)百分率最高為90.34%，種群水平平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為76.45%。

用Popgene32對(duì)不同裸果木自然種群的遺傳多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表3)，裸果木種群觀察等位基因數(shù)在1.372 4～1.903 4，有效等位基因數(shù)在1.252 9～1.484 2，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)在0.145 6～0.285 1，Shannon’s信息多樣性指數(shù)在0.214 4～0.432 0，其中哈密廟爾溝(HM)裸果木種群在幾個(gè)遺傳多樣性指標(biāo)均高于其它裸果木種群，疏附(SF)種群最低。整體而言，裸果木物種水平上的遺傳多樣性相對(duì)豐富，觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s信息多樣性指數(shù)分別為1.972 4、1.436 9、0.263 8和0.408 1；而種群水平上的遺傳多樣性相對(duì)較低，幾個(gè)遺傳多樣性指標(biāo)平均值分別為1.764 5、1.350 4、0.213 7和0.331 6。對(duì)裸果木種群的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s信息多樣性指數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明：哈密三道嶺(HS)分別與哈密廟爾溝(HM)、烏恰(WQ)種群的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s信息多樣性指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，與其它種群存在顯著差異(P<0.05)；疏附(SF)與輪臺(tái)(LT)、拜城(BC)、庫車(KC)種群的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，與其它種群存在顯著差異(P<0.05)；疏附(SF)與庫車(KC)種群的Shannon’s信息多樣性指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，與其它種群的差異存在顯著差異(P<0.05)。

表3 裸果木自然種群的遺傳多樣性指標(biāo)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)P.多態(tài)位點(diǎn)數(shù)；PPB.多態(tài)位點(diǎn)百分率；na.觀測等位基因；ne.有效等位基因數(shù)；H. Nei’s遺傳多樣性指數(shù)；I. Shannon’s信息多樣性指數(shù)

Note:The data with different little letters in same column show significant difference(P<0.05)P. Number of polymorphic loci;PPB. Percentage of polymorphic bands;na. Observed number of alleles;ne. Gene diversity in subdivided populations;H. Nei’s gene diversity;I. Shannon’s information index

2.2 裸果木種群的遺傳結(jié)構(gòu)

裸果木總的基因多樣性(Ht)為0.261 8，種群內(nèi)的基因多樣性(Hs)占81.61%，為0.213 7，種群間遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.183 9，表明種群間的基因多樣性(Ht-Hs)占18.39%，為0.048 1，基于遺傳分化系數(shù)而得出的基因流(Nm)為1.109 4。從表4可看出，裸果木各種群間的遺傳一致度在0.887 9～0.972 7，庫車(KC)和哈密三道嶺(HS)種群的遺傳一致度最小，哈密三道嶺(HS)與哈密廟爾溝(HM)種群的遺傳一致度最大；裸果木種群間的遺傳距離在0.027 7～0.118 9，其中庫車(KC)和哈密三道嶺(HS)種群的遺傳距離最遠(yuǎn)，哈密三道嶺(HS)與哈密廟爾溝(HM)種群的遺傳距離最近。Mantel檢驗(yàn)結(jié)果表明裸果木種群遺傳距離與地理距離之間不存在顯著相關(guān)性(r=0.239 8，P>0.05)。

表4裸果木自然種群間的遺傳一致度和遺傳距離

Table4GeneticidentityandgeneticdistanceofG.przewalskiipopulations

LTWQBCSFKCHMHSLT****0.96980.96280.89180.90350.93320.9246WQ0.0306****0.97060.91990.92950.94560.9333BC0.03790.0298****0.91310.93050.94380.9318SF0.11460.08350.0909****0.96540.90210.8901KC0.10150.07310.07200.0352****0.90020.8879HM0.06920.05600.05790.10300.1051****0.9727HS0.07840.06900.07060.11640.11890.0277****

注:對(duì)角線上方為Nei’s 遺傳一致度，對(duì)角線下方為遺傳距離。

Note:Nei’s genetic identity(above diagonal) and genetic distance(below diagonal).

為了探討裸果木個(gè)體間的親緣關(guān)系，根據(jù)SCoT標(biāo)記所獲得的結(jié)果，分別進(jìn)行主坐標(biāo)分析和STRUCTURE分析。主坐標(biāo)分析結(jié)果見圖2，第1、2主成分分別解釋了12.4704%和7.2422%的樣本相關(guān)性，201株裸果木大致可以被分為3大組：第一組以哈密兩個(gè)種群為主，第二組以烏恰(WQ)、輪臺(tái)(LT)和拜城(BC)種群為主，第三組以庫車(KC)、疏附(SF)種群為主。STRUCTURE分析表明，當(dāng)K=5時(shí)，ΔK散點(diǎn)曲線出現(xiàn)最大值，出現(xiàn)明顯拐點(diǎn)，說明201株裸果木被分為5個(gè)組群(圖3)。裸果木個(gè)體歸屬于各組群的結(jié)果顯示：組群1(藍(lán)色)以哈密兩個(gè)種群為主，組群2(綠色)以輪臺(tái)(LT)和烏恰(WQ)種群為主，組群3(黃色)以烏恰(WQ)和拜城(BC)為主，組群4(粉紅色)以疏附(SF)和庫車(KC)為主，組群5(紅色)包含庫車(KC)、哈密廟爾溝(HM)和哈密三道嶺(HS)種群部分裸果木個(gè)體(圖4)。

圖2 裸果木201株個(gè)體的主坐標(biāo)分析圖Fig.2 Principal coordinate analysis for 201 individuals of G.przewalskii

圖3 Delta K(ΔK)值隨組群數(shù)的變化圖Fig.3 Plot of the Delta K(ΔK) on the number of population genetic clusters

3 討論

3.1 裸果木的遺傳多樣性

在物種水平上，裸果木多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)為97.24%，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息多樣性指數(shù)(I)分別為0.263 8和0.408 1，明顯高于我國干旱地區(qū)孑遺植物蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus，I=0.102 6)和新疆沙冬青(A.nanus，I=0.070)[24]，與蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)和長葉紅砂(Reaumuriatrigyna)[5,25]等曾在第三紀(jì)或更早廣泛分布的孑遺植物相同，具有較高的遺傳多樣性。一些研究表明物種遺傳多樣性的維持與其繁育系統(tǒng)、種子傳播機(jī)制、生活型、地理分布和系統(tǒng)進(jìn)化歷史有關(guān)，其中繁育系統(tǒng)和系統(tǒng)進(jìn)化歷史是影響物種遺傳多樣性的重要因素[26～27]。裸果木作為第三紀(jì)孑遺植物，較長的進(jìn)化歷史所積累的突變，導(dǎo)致其具有豐富的遺傳基礎(chǔ)，由于其受第四紀(jì)冰川作用的影響，現(xiàn)有幸存種群可能保留和繼承了了祖先總體豐富的遺傳基礎(chǔ)，使其具有較高的遺傳多樣性。在我們前期研究中，發(fā)現(xiàn)裸果木具有以異交為主，部分自交親和，需要傳粉者的混合繁育系統(tǒng)類型[18]， 可以通過有性重組產(chǎn)生新的基因型，從而維持其種群的遺傳多樣性。在種群水平上，裸果木自然種群的遺傳多樣性指標(biāo)變化范圍較大，具有較高的遺傳多樣性，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s信息多樣性指數(shù)的顯著性分析表明，各種群間遺傳多樣性有較大差異(表3)，這可能與種群大小和人為干擾等因素有關(guān)，如疏附種群遺傳多樣性較低，可能是由于規(guī)模較小，部分植株又因修路而被砍伐，所剩個(gè)體數(shù)量較少，容易引起種群內(nèi)近交和遺傳漂變的發(fā)生而導(dǎo)致遺傳多樣性的喪失。

圖4 STRUCTURE對(duì)裸果木遺傳結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig.4 Results of genetic structure analyses of G.przewalskii by STRUCTURE

3.2 裸果木的遺傳結(jié)構(gòu)

裸果木遺傳分化系數(shù)為0.183 9，說明其遺傳變異主要來自種群內(nèi)，種群間存在一定程度的分化。裸果木的基因流為1.109 4，表明裸果木種群間存在著一定程度的基因交流，可能是因?yàn)楫惤粸橹鞯姆庇到y(tǒng)促進(jìn)了種群個(gè)體間的基因交流，這有利于減小其因遺傳漂變引起的種群間的分化。一些學(xué)者提出，種群間沒有完全的地理隔離或空間隔離，存在一定程度基因流[28～29]。本文中裸果木種群地理距離均較遠(yuǎn)，其中哈密廟爾溝(HM)和哈密三道嶺(HS)種群分布在天山東段的哈密盆地，其余種群沿天山南麓不連續(xù)地分布在塔里木盆地西部和北部。我們猜測裸果木種群間存在一定的基因交流，但不完全隔離導(dǎo)致其種群間產(chǎn)生了一定程度的分化。

運(yùn)用主坐標(biāo)分析(PCoA)和STRUCTURE分析對(duì)裸果木個(gè)體聚類分析存在一定差異，但總體上結(jié)果是一致的。這可能是因?yàn)橹髯鴺?biāo)分析(PCoA)是根據(jù)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行遺傳聚類，而STRUCTURE分析是基于模型，以似然值或貝葉斯方法進(jìn)行群體聚類[30～31]。有關(guān)對(duì)同種植物采用不同方法進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析而結(jié)果不一致的研究也有報(bào)道[7,32]。兩種聚類分析方法均表明地理距離近的種群不一定優(yōu)先聚在一起，Mantel檢驗(yàn)的結(jié)果表明裸果木種群地理距離與遺傳距離不存在顯著相關(guān)性也證明了這一點(diǎn)。這說明除地理隔離外，群體間現(xiàn)有的遺傳結(jié)構(gòu)還可能與裸果木的進(jìn)化歷史和各種群的人為破壞程度等因素有關(guān)。有研究表明，第四紀(jì)冰期和間冰期氣候變化反復(fù)導(dǎo)致植物在冰期退縮到生境適宜的避難所，冰期后又從避難所遷移擴(kuò)散到其他地區(qū)[33～34]，隨著第四紀(jì)冰期后氣候變暖，拜城(BC)、輪臺(tái)(LT)和庫車(KC)種群可能分別由位于塔里木盆地避難所的烏恰(WQ)和疏附(SF)種群快速擴(kuò)張形成的。人為干擾也可能會(huì)對(duì)物種的遺傳分化造成一定影響[35]，在野外調(diào)查中發(fā)現(xiàn)高頻繁的人為活動(dòng)造成部分裸果木種群逐漸縮小，如疏附(SF)種群由于修路導(dǎo)致部分植株被砍伐，可能會(huì)降低種群間基因交流強(qiáng)度，加劇遺傳分化程度。林樂靜等[36]研究認(rèn)為修路和開荒毀林導(dǎo)致伯樂樹(Bretschneiderasinensis)部分種群數(shù)量和規(guī)模減少，可能會(huì)加劇種群遺傳分化，李龍梅等[37]發(fā)現(xiàn)馬褂木(Liriodendronchinense)東部組遺傳分化較高，這可能與人為活動(dòng)頻繁致使群體規(guī)模劇減有關(guān)。

3.3 裸果木的保護(hù)

裸果木遭樵采和駱駝啃食嚴(yán)重，暴雨和山洪等自然災(zāi)害也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定程度的影響，造成裸果木個(gè)體數(shù)量日趨減少。在前期研究中發(fā)現(xiàn)裸果木結(jié)實(shí)率低，傳粉媒介和花粉傳播受到限制。裸果木目前雖具有較高的遺傳多樣性，但隨著裸果木有性生殖持續(xù)受到限制以及個(gè)體數(shù)量進(jìn)一步減少，其遺傳多樣性很可能會(huì)逐漸降低。根據(jù)本文的研究結(jié)果，建議制定保護(hù)措施如下：第一，就地保護(hù)，當(dāng)?shù)卣梢栽诼愎具z傳多樣性高和分布集中的地區(qū)(如哈密廟爾溝、哈密三道嶺和烏恰)建立自然保護(hù)區(qū)，嚴(yán)禁亂墾濫伐，就地保護(hù)裸果木；第二，遷地保護(hù)，在進(jìn)行遷地保護(hù)的過程中應(yīng)考慮近交衰退和遠(yuǎn)交衰退的影響[38]，應(yīng)根據(jù)種群聚類結(jié)果，有選擇性地從不同自然種群引種(如從疏附引種到哈密兩個(gè)種群)，人為提高種群的基因交流，增強(qiáng)物種進(jìn)化潛力；第三，在花期對(duì)傳粉昆蟲訪問較少的裸果木個(gè)體補(bǔ)授花粉，以提高其有性生殖的能力，從而提高其種群內(nèi)的遺傳多樣性。