卓 維 陳 倩 羅 銀 楊尚諭 魯黎明 李立芹*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，成都 611130； 2.作物科學國家級實驗教學示范中心，成都 611130)

植物在自然生長過程中，會受一些非生物逆境的影響。為了適應環(huán)境，體內(nèi)形成了一個復雜的信號傳導網(wǎng)絡(luò)，可通過激活一些轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元的相互作用，產(chǎn)生特定的轉(zhuǎn)錄表達以抵抗脅迫。AP2/ERF(PETALA2/Ethylene-responsive factor)超家族是植物中一類特有的轉(zhuǎn)錄因子[1]，乙烯應答轉(zhuǎn)錄因子ERF是AP2/ERF家族的一個亞族，具有AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子所共有的AP2特征結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由60～70個高度保守氨基酸構(gòu)成[2]。AP2結(jié)構(gòu)域能夠識別含有GCC-box或DRE/CRT(C-Repeat/Dehydration-Responsive Element)順式作用元件基因的啟動子，作為反式作用因子調(diào)控靶基因表達[3]。研究發(fā)現(xiàn)，不同物種的ERF轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量不同，番茄中有85個[4]，黃瓜中有103個[5]，甜瓜中有136個ERF家族基因[6]。

ERF作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，對植物的生長發(fā)育以及逆境脅迫應答反應有著重要調(diào)控作用[7]。并且在辣椒，擬南芥，大豆等植物研究中都有報道。辣椒CaJERF1基因在300 mmol·L-1NaCl和4℃冷處理1～24 h后表達量上調(diào)[8]；怪柳中16個ThERF基因家族成員在400 mmol·L-1NaCl處理之下表達情況不同，根中10個ThERF成員在3 h都被抑制，后隨處理時間增加緩慢上升，24 h迅速下降；莖中有9個ThERF成員被顯著誘導[9]。大豆GmERF056和GmERF057在干旱、高鹽和ABA處理下均能夠被誘導表達，但低溫處理后沒有顯著差異[10]。水稻中過表達OsERF71基因通過參與細胞壁組分的合成，改變根形態(tài)提高水稻的干旱耐受性[11]。

本研究從普通煙草K326中克隆到一個乙烯轉(zhuǎn)錄因子ERF基因NtTOE3，利用生物信息學分析NtTOE3蛋白相關(guān)性質(zhì)，同時運用qRT-PCR研究其在煙草中的組織表達水平，以及6種非生物逆境脅迫下基因的表達水平，旨在為今后煙草ERF家族關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的篩選以及其功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

試驗植物材料為煙草栽培品種K326(Nicotianatabacumcv.K326)，由四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院提供。

大腸桿菌DH5α購自Vazyme Biotech公司；目的基因的克隆及回收使用的Trizol試劑、載體PMD19-T、高保真Pfu酶，cDNA合成試劑盒，SYBR Green Master mix、限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit 2.0等試劑購自TaKaRa，DNA凝膠純化回收試劑盒購自天根公司；引物合成與測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料處理

選取均一飽滿的煙草種子進行表面消毒然后布種，消毒方法和配置培養(yǎng)基方法參考張雪薇[12]，配置NaCl(200 mmol·L-1)、PEG-6000(5%)、ABA(1 μmol·L-1)、H2O2(10 mmol·L-1)和低鉀(10 μmol·L-1K+)培養(yǎng)基。處理相應時間(0、3、6、12、24 h)后進行整株取樣，提取RNA后分析NtTOE3在6種非生物逆境脅迫下的表達模式。提取煙草K326幼苗的根、莖、葉以及盛花期的花RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后分析NtTOE3在各個組織的表達情況。

1.2.2煙草NtTOE3基因的克隆和過表達載體的構(gòu)建

參考GenBank收錄的美花煙草(Nicotianasylvestris)NsTOE3序列(XM_009783708.1)，采用同源克隆的方法，用DNAMAN軟件設(shè)計全長引物NtTOE3-F和NtTOE3-R，帶有酶切位點(BamHⅠ和EcoRⅠ)的載體引物NtTOE3-mF和NtTOE3-mR。(表1)。擴增后將純化的目的片段與pMD19-T載體16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，氨芐青霉素抗篩選陽性克隆，測序鑒定。將重組克隆載體pMD19-T和過表達載體PBI121分別用內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，同上方法轉(zhuǎn)化后用對應抗性篩選陽性克隆，培養(yǎng)后送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.3 煙草NtTOE3蛋白生物信息學分析

利用ExPASyProtParam tool分析NtTOE3蛋白的理化性質(zhì)；用SOPMA和SWISS-MODEL軟件預測蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)；用ProtScale，DNAMAN軟件分析蛋白的疏水性和結(jié)構(gòu)域；采用PSORT預測NtTOE3的亞細胞定位；運用MEGA5和clustalx-2.0.9軟件以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 煙草NtTOE3基因的表達分析

根據(jù)基因序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計qRT-PCR引物NtTOE3-qF和NtTOE3-qR，采用煙草的18SrRNA為內(nèi)參進行表達差異研究。qRT-PCR反應結(jié)束后，用2-ΔΔCt方法進行計算基因相對表達水平(表1)。

表1 引物序列

GGATCC.BamHⅠ； GAATTC.EcoRⅠ

2 結(jié)果與分析

2.1 NtTOE3基因克隆

以煙草K326葉片cDNA為模板進行PCR擴增，電泳結(jié)果顯示在1 000～1 500 bp的位置上有清晰的條帶(圖1)。將該條帶回收純化后與pMD19-T載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。將鑒定出的陽性克隆隨機挑選3個送至測序公司進行測序，測序結(jié)果顯示：目的片段大小為1 356 bp。后提取質(zhì)粒用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切驗證，酶切后檢測目的條帶(圖2)。

圖1 NtTOE3基因的克隆 M. Marker 2 000 bp；1. NtTOE3基因Fig.1 Cloning of NtTOE3 gene M. Marker 2 000 bp; 1. NtTOE3 gene

圖2 pMD19-NtTOE3重組質(zhì)粒雙酶切條帶 M. Marker 2 000 bp；1.NtTOE3基因Fig.2 Digesting of pMD19-NtTOE3 recombinant plasmid M. Marker 2 000 bp; 1. NtTOE3 gene

圖3 NtTOE3基因陽性克隆PCR擴增電泳圖M. Marker 2 000 bp；1～7.NtTOE3基因菌落PCR；8.陽性對照Fig.3 Electrophoresis analysis of NtTOE3 positive clone PCR product M. Marker 2 000 bp; 1-7. NtTOE3 colony PCR product; 8. Positive control

圖4 NtTOE3-PBI121重組質(zhì)粒雙酶切條帶 M. Marker 2 000 bp；1.NtTOE3基因Fig.4 Digesting of NtTOE3-PBI121 recombinant plasmid M. Marker 2 000 bp; 1. NtTOE3 gene

2.2 NtTOE3-PBI121過表達載體的構(gòu)建與檢測

將NtTOE3基因連接到PBI121載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，用菌落PCR篩選陽性克隆。結(jié)果顯示(圖3)，2～6為陽性克隆。挑選3個陽性克隆送至公司測序，搖菌提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后檢測目的條帶(圖4)。雙酶切和測序結(jié)果均表明，NtTOE3已正確插入PBI121載體中，NtTOE3-PBI121過表達載體的構(gòu)建成功。

2.3 NtTOE3基因的生物信息學分析

2.3.1 NtTOE3編碼蛋白的理化性質(zhì)及疏水性分析

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析顯示，NtTOE3基因共編碼451個氨基酸，其中絲氨酸Ser(12.2%)含量最高，半胱氨酸Cys(0.7%)含量最低，帶負電荷氨基酸(Asp+Glu)51個，帶正電荷氨基酸(Arg+Lys)55個。該蛋白預測的分子量為49.84 ku，理論等電點pI為8.70，其親水性平均指數(shù)為-0.783，用在線軟件ProtScale進行的疏水性分析(圖5)，結(jié)果預測該蛋白屬于親水性蛋白。

2.3.2 NtTOE3蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)預測

利用SOPMA對NtTOE3編碼的蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)，該蛋白中52.11%的氨基酸參與無規(guī)則卷曲(Random coil)，15.74%的氨基酸參與α-螺旋(Alpha helix)，22.17%的氨基酸參與延伸鏈(Extended strand)，9.98%的氨基酸參與β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)，由此可見， 該蛋白二級結(jié)構(gòu)的最大元件為無規(guī)則卷曲(圖6)。運用SWISS-MODEL對NtTOE3的三級結(jié)構(gòu)進行了預測，RasTop軟件進行顯示(圖7)，并將結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預測進行比照，結(jié)果較為統(tǒng)一。

圖5 NtTOE3蛋白疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis NtTOE3 protein

圖6 ANtTOE3蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測Fig.6 Predicted secondary structure of NtTOE3 protein

圖7 BNtTOE3蛋白的三維結(jié)構(gòu)預測結(jié)果Fig.7 The predicted advanced structure of NtTOE3 protein

2.3.3 NtTOE3蛋白的結(jié)構(gòu)域及亞細胞定位分析

利用DNAMAN軟件進行NtTOE3與其他5個不同物種的AP2保守結(jié)合域序列比對，包括美花煙草NsTOE3、川椒CaTOE3、番茄SlTOE3、苦瓜McTOE3、葡萄VvTOE3，結(jié)果顯示6種植物的AP2結(jié)合域非常保守(圖8)。

利用PSORT在線預測NtTOE3的亞細胞定位，結(jié)果顯示，該蛋白在細胞核上占0.696，在細胞質(zhì)上占0.174，在細胞骨架中占0.043，在線粒體中占0.043，預測NtTOE3可能定位在細胞核上。

2.3.4 NtTOE3同源性分析

把NtTOE3編碼的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對， 按照相似性程度高低選擇美花煙草(Nicotianasylvestris)、煙草(Nicotianaattenuata)、辣椒(Capsicumannuum)、番茄(Solanumlycopersicum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、苦瓜(Momordicacharantia)、葡萄(Vitisvinifera)、牽?；?Ipomoeanil)、麻瘋樹(Jatrophacurcas)等19個不同物種的TOE3蛋白序列與NtTOE3構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖9)。結(jié)果表明：NtTOE3和美花煙草、煙草聚為一支，相似性分別為96%和95%，與結(jié)構(gòu)域比對結(jié)果一致；其次是與辣椒、番茄和馬鈴薯相似性分別為76%、72%和64%；與葡萄、苦瓜相似性最低，分別是56%和55%。

圖8 NtTOE3蛋白與5種植物TOE3蛋白的AP2保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.8 AP2 conserved domain analysis ofNtTOE3protein and five plant TOE3proteins NsTOE3. Nicotiana sylvestris; CaTOE3. Capsicum annuum; SlTOE3. Solanum lycopersicum; McTOE3. Momordica charantia; VvTOE3. Vitis vinifera

圖9 NtTOE3進化樹分析Fig.9 The phylogenetic tree analysis of NtTOE3

2.4 NtTOE3的組織表達分析

采用qRT-PCR反應分析NtTOE3的組織表達情況。結(jié)果表明，NtTOE3在煙草根、莖、葉、花中均有表達，但主要是在莖和葉中表達，在花中的表達量最低。其中莖中表達量是在葉中的9.41倍，是花中的53.74倍。說明煙草NtTOE3主要在莖中表達(圖10)。

圖10 NtTOE3在不同組織中的相對表達量分析Fig.10 Analysis of relative expression of NtTOE3 in different tissues

圖11 NtTOE3在6種非生物逆境脅迫下處理后的相對表達量Fig.11 Relative expression of NtTOE3 under six kinds of abiotic stress treatment

2.5 6種非生物逆境脅迫下NtTOE3的表達分析

采用qRT-PCR分析NtTOE3在6種處理后的表達情況。高鹽(200 mmol·L-1NaCl)處理后，NtTOE3表達量在3～12 h逐漸增加，最高值出現(xiàn)在12 h，為對照(0 h)的1.86倍；在低鉀(10 μmol·L-1K+)處理后，該基因表達量在3～6 h逐漸上升，最高值為對照(0 h)的44.36倍，后其表達量下降，但均高于對照(圖11A)；10 mmol·L-1H2O2和5% PEG-6000處理后，該基因都在24 h達到最大，分別為對照(0 h)的6.81和19.66倍。在1 μmol·L-1ABA和冷處理(4℃)下，NtTOE3表達情況有所不同。1 μmol·L-1ABA處理之后，該基因3 h表達先下降，后隨著處理時間增加表達量逐漸增加，24 h與對照無差異。冷處理(4℃)后，該基因逐漸下降，最低為24 h，僅為對照的9.42%(圖11B)。實驗結(jié)果說明，NtTOE3能夠響應逆境脅迫，受到NaCl、低鉀、PEG-6000和H2O2誘導，也受到4℃和ABA處理抑制。

3 討論

乙烯轉(zhuǎn)錄因子ERF屬于植物AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族，參與細胞發(fā)育、激素合成等生理反應，同時在植物抗病、低溫、干旱、高鹽等逆境信號轉(zhuǎn)導中具有重要作用，該基因在不同植株中的超表達能夠提高其抗性，并具有一定的廣譜效應[13]。本試驗從普通煙草K326中克隆到一個NtTOE3基因，分析發(fā)現(xiàn)NtTOE3有由54個氨基酸殘基組成的AP2保守結(jié)構(gòu)域，且不同物種之間該結(jié)構(gòu)域保守。同源性比較發(fā)現(xiàn)，該蛋白與美花煙草、川椒和番茄TOE3等具有較高同源性。亞細胞定位預測表明NtTOE3可能定位在細胞核中。丹參SmERF1，巴西蕉MaERF25蛋白均定位到細胞核[14～15]，煙草中ERF蛋白家族絕大部分成員定位在細胞核，少數(shù)定位在線粒體和葉綠體上[16]。

本研究利用qRT-PCR分析NtTOE3在煙草K326不同組織中的表達水平，結(jié)果顯示該基因在根、莖、葉、花中均有表達，莖中表達量最高，推測TOE3可能參與煙草莖和葉的生長發(fā)育以及滲透調(diào)節(jié)。這與茶樹和油菜ERF的組織表達情況不一樣，茶樹CsERF-B3主要在根中表達，油菜BnaERFB1-2則集中在分生組織[17～18]；而大豆GmERF的研究發(fā)現(xiàn)，該基因主要分布在葉和根中，同時在莖、花、胚中也有表達[19]。說明不同的ERF家族基因在不同植物中分布不同，其參與植物生長發(fā)育的整個時期，且存在組織特異性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在高鹽(200 mmol·L-1NaCl)處理下，NtTOE3表達量最高值出現(xiàn)在12 h，說NtTOE3表達受到高鹽誘導。這與楊樹48個ERFs在響應鹽脅迫下的表達模式相同，處理后ERFs上調(diào)的倍數(shù)在2～32倍。轉(zhuǎn)楊樹ERF76的煙草在鹽處理下表現(xiàn)出抗逆境保護分子含量升高，相對電導率和活性氧積累的減少，說明ERF76是一個鹽脅迫誘導表達基因[20～21]。在野大豆GsERF的研究發(fā)現(xiàn)，NaHCO3鹽堿脅迫下，GsERF71通過上調(diào)H+-ATPase的表達水平和提高生長素的積累來增強耐受性，從而植株表現(xiàn)出葉片較綠，更長的根長等現(xiàn)象[22]。除此之外，擬南芥中ERF96在100 mmol·L-1NaCl處理下被大量誘導，與鹽處理相關(guān)的Marker基因如RD29A、P5CS、KIN1等積極響應，與Na+和K+含量以及Na+/K+穩(wěn)態(tài)有關(guān)的K+外向整流器SKOR和鉀轉(zhuǎn)運AKT2/3上調(diào)，說明AtERF96是擬南芥中耐鹽性的正調(diào)節(jié)因子[23]。轉(zhuǎn)番茄SpERF-B7的擬南芥植株在130 mmol·L-1NaCl處理15 d后，其鮮重和根長明顯優(yōu)于野生型，同時該基因受到甘露醇，ABA和乙烯誘導表達，推測SpERF-B7受乙烯/ABA途徑影響從而改善耐鹽性[24]。

5%PEG-6000模擬干旱處理后，NtTOE3表達量隨著處理時間的增加逐漸升高，最高點24 h是對照的19.66倍。這與大豆GmERF7的表達模式一致，在20%PEG-6000處理后顯著誘導[25]。其他研究發(fā)現(xiàn)，針茅SpERF1可能參與植物脯氨酸合成，通過脯氨酸累積量使細胞具有較好的緩沖能力和膜保護作用[26]；而水稻ERF基因則是激活與干旱脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，同時改變水稻根部結(jié)構(gòu)包括調(diào)控細胞壁松弛度及木質(zhì)素生物合成基因直接作用根部結(jié)構(gòu)來提高其耐旱性。ERF基因也可以提高乙烯生物合成調(diào)節(jié)水稻的抗旱性[27～29]。在擬南芥中過表達ERF1能夠提高植株對干旱和鹽脅迫的耐受性，在不同鹽濃度(100、200、300 mmol·L-1NaCl)處理下，過表達植株的發(fā)芽率，存活率，體內(nèi)ABA和脯氨酸含量明顯比野生型高。因為脯氨酸含量的積累程度直接反應了植物在脅迫下的滲透調(diào)節(jié)能力，脫落酸能夠部分調(diào)整脯氨酸的積累，這表明ERF1可能通過調(diào)節(jié)ABA含量和依賴ABA信號傳導途徑對植株進行調(diào)節(jié)[30]。

本試驗NtTOE3在脅迫條件的表達模式推測該基因面對逆境存在不同的應答機制，可能是由于DNA結(jié)合特性不同或者是存在翻譯后水平調(diào)控，也有可能是與不同蛋白相互作用的結(jié)果。所以煙草NtTOE3蛋白在非生物逆境脅迫中發(fā)揮的具體作用，尚待進一步研究。今后可構(gòu)建GFP融合表達蛋白確定其亞細胞定位，構(gòu)建原核表達載體表達蛋白，通過酵母單雜交實驗尋找NtTOE3的下游靶基因，同時過表達載體轉(zhuǎn)化煙草后深入研究NtTOE3基因的功能，為從分子水平闡明NtTOE3蛋白在非生物逆境脅迫中的作用機制提供科學依據(jù)。