李春英 張晶晶 趙春建 姜宏偉 任雪婷 蘇偉然 關(guān)佳晶 李玉正

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

在植物根際定植的有益真菌和細(xì)菌可以促進(jìn)植物對礦物元素的吸收和利用，或者產(chǎn)生促進(jìn)植物生長的次生代謝產(chǎn)物。這些定植在根際可直接或間接對植物生長產(chǎn)生促進(jìn)作用的細(xì)菌和真菌分別被命名為植物根際促生細(xì)菌(PGPR)和根際植物促生真菌(PGPF)[1～2]。基于PGPR和PGPF在可持續(xù)的問題上對作物生產(chǎn)的重要性，它們在植物生長的過程中扮演的角色被廣泛研究[3]。PGPR/PGPF-植物相互作用的因素包括生物肥料、生物防治、植物刺激和揮發(fā)性信號釋放等[4]。在過去的十年中，揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)能誘導(dǎo)植物生長這一現(xiàn)象及其相關(guān)機(jī)制已有報(bào)道[5～7]。據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌(Bacillus)BCT9釋放的揮發(fā)物可以作為生長調(diào)節(jié)劑對萵苣幼苗生長起促進(jìn)作用[8]。Hung[9]報(bào)告，天然存在23種不同的真菌VOCs能對植物的生長和健康產(chǎn)生正面或負(fù)面影響。由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)GB03和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)IN937a產(chǎn)生的2，3-丁二醇和3-羥基丁酮，由巨大芽孢桿菌(B.megaterium)XTBG34產(chǎn)生的2-戊基呋喃等均可促進(jìn)植物生長[6,10～11]。3-甲基-1-丁醇是芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)和莖點(diǎn)霉屬(Phoma)微生物等釋放的一種常見VOC[12～14]。一些報(bào)道研究了包括3-甲基-1-丁醇在內(nèi)的多種VOC混合物對植物生長的影響：例如，將煙草暴露于2-甲基丙醇，3-甲基-1-丁醇，甲基丙烯酸和乙酸異丁酯等的混合物后，發(fā)現(xiàn)其鮮重有顯著的增加[12]。但單獨(dú)的3-甲基-1-丁醇處理對植物萌發(fā)和生長的影響尚鮮見報(bào)道。產(chǎn)生3-甲基-1-丁醇的常見菌屬如芽孢桿菌屬和假單胞桿菌屬微生物常在如小麥、玉米等作物根際定植。因此，本文研究了3-甲基-1-丁醇對小麥和玉米種子萌發(fā)的影響，以初步探查3-甲基-1-丁醇在介導(dǎo)微生物-植物種間化學(xué)關(guān)系中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥種子(科農(nóng)2009)和玉米種子(遼單120)購于哈爾濱種子市場。3-甲基-1-丁醇(99%)購于阿拉丁試劑有限公司(上海)。

1.2 種子實(shí)驗(yàn)

將小麥和玉米種子在0.4% KMnO4溶液中浸泡20分鐘進(jìn)行表面消毒，用無菌蒸餾水洗滌幾次去除殘留的KMnO4溶液，然后均勻地?cái)[放在直徑9 cm的無菌培養(yǎng)皿中(每皿30粒種子)，皿內(nèi)放置用10 mL 3-甲基-1-丁醇水溶液預(yù)先潤濕的雙層濾紙。培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙每天更換，并設(shè)定10 mL濃度的3-甲基-1-丁醇潤濕。每次更換濾紙后，將培養(yǎng)皿密封。以無菌蒸餾水處理作為對照。每種處理濃度(1、10、100 mg·L-1)設(shè)3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)皿保持在27±2℃和70%相對濕度下，光周期為16 h光照/8 h黑暗，持續(xù)5天。

1.3 萌發(fā)指標(biāo)的測定

以胚根突破種皮1 mm視為發(fā)芽。播種后每天計(jì)數(shù)并記錄發(fā)芽種子的數(shù)量。通過以下公式計(jì)算發(fā)芽率，發(fā)芽勢，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)：

(1)

(2)

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)

(3)

式中：Dt表示發(fā)芽總天數(shù)；Gt表示第t天的發(fā)芽數(shù)。

活力指數(shù)(VI)=發(fā)芽指數(shù)(GI)×種子鮮重

(4)

1.4 胚根長和胚芽長的測量

在為期5天的培養(yǎng)結(jié)束后，測量發(fā)芽種子的胚根長和胚芽長，并計(jì)算每組的平均數(shù)，最后結(jié)果以cm計(jì)。

1.5 鮮重測量

在為期5天的培養(yǎng)結(jié)束后，測量種子的鮮重，并計(jì)算每組的平均數(shù)，最后結(jié)果以g計(jì)。

1.6 生化指標(biāo)分析

在培養(yǎng)結(jié)束后，對萌發(fā)的種子進(jìn)行以下生化指標(biāo)的測定：SOD活性參考何文平等[15]的方法，采用氮藍(lán)四銼(NBT)光化還原法測定；可溶性糖含量參考李娜等[16]的方法,采用蒽酮比色法測定；可溶性蛋白的測定依據(jù)Bradford[17]的方法，采用考馬斯亮藍(lán)法測定；葉綠素含量，采用乙醇提取，分光光度法測定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPASS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，ANNOA和LSD檢驗(yàn)分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 3-甲基-1-丁醇對小麥和玉米種子萌發(fā)的影響

不同濃度3-甲基-1-丁醇處理對小麥和玉米種子萌發(fā)的影響見表1。表1數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，1 mg·L-1的3-甲基-1-丁醇處理下，兩種受試植物種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢或發(fā)芽指數(shù)均較對照組有所增加，但差異不顯著(P>0.05)。1和10 mg·L-13-甲基-1-丁醇處理的兩種受試植物種子活力指數(shù)顯著增加：與對照組相比，1和10 mg·L-13-甲基-1-丁醇處理下的小麥種子活力指數(shù)分別提高8.76%(P=0.040)和6.09%(P=0.011)；1和10 mg·L-13-甲基-1-丁醇處理下的玉米種子活力指數(shù)分別提高17.12%(P=0.023)和21.06%(P=0.008)。100 mg·L-13-甲基-1-丁醇處理下的小麥和玉米種子活力指數(shù)與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表1 3-甲基-1-丁醇對小麥和玉米種子萌發(fā)的影響

注：同列不同的小寫字母表示兩組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05)。單因素方差分析后，用LSD法做兩兩比較。

Note:Different lowercase letters in the same column indicate statistical differences between treatment groups atP<0.05,analysis ofvariance(ANOVA),followed by LSD test.

圖1 不同濃度3-甲基-1-丁醇處理對玉米和小麥胚芽(A)和胚根長度(B)的影響 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=3)，各柱形圖上不同的小寫字母表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。Fig.1 Effects of 3-methyl-1-butanol in different concentrations on germ(A) and radicle(B) length of maize and wheat Error bars indicate standard error (n=3).Different lowercase letters denote statistical differences between treatmentgroups at the 5% level according to LSD test

圖2 不同濃度的3-甲基-1-丁醇對小麥和玉米胚芽SOD活性的影響Fig.2 Effects of 3-methyl-1-butanol in different contents on SOD activity of maize and wheat germ

不同濃度3-甲基-1-丁醇處理對兩種受試種子胚根和胚芽長的影響見圖1。圖1數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，在1和10 mg·L-1的3-甲基-1-丁醇處理下，兩種受試植物種子的胚根和胚芽長度均較對照組提高，但差異不顯著(P>0.05)。100 mg·L-13-甲基-1-丁醇的處理，抑制了兩種受試植物種子的胚根和胚芽生長(P<0.05)。

2.2 3-甲基-1-丁醇對小麥和玉米種子生化指標(biāo)

2.2.1 SOD活性

如圖2所示，3-甲基-1-丁醇處理，對小麥種子SOD活性無顯著影響(P>0.05)。3種濃度的3-甲基-1-丁醇處理均可顯著提高玉米種子活性：與對照組相比，1、10和100 mg·L-13-甲基-1-丁醇處理下，玉米種子SOD活性分別提高了89.70%(P=0.010),95.71%(P=0.007)和67.64%(P=0.013)。

2.2.2 可溶性糖和可溶性蛋白含量

不同濃度3-甲基-1-丁醇處理對兩種受試種子可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響見圖3。如圖3A所示，隨著3-甲基-1-丁醇濃度的增加，小麥和玉米種子可溶性糖含量均呈先降低再升高的趨勢，但各處理組與對照組相比，差異不顯著。如圖3B所示，隨著3-甲基-1-丁醇濃度的增加，兩種受試作物種子可溶性蛋白含量也呈先降低再升高的趨勢，且各組可溶性蛋白含量之間無顯著差異。

圖3 不同濃度的3-甲基-1-丁醇對的小麥和玉米種子可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影響Fig.3 Effects of 3-methyl-1-butanol in different contents on soluble sugar(A) and protein(B) of maize and wheat

2.2.3 葉綠素含量

3-甲基-1-丁醇對玉米和小麥種子幼芽總?cè)~綠素的影響如圖4所示。隨著3-甲基-1-丁醇濃度的增加，小麥和玉米幼芽葉綠素含量均呈先增加再減少的趨勢。1 mg·L-13-甲基-1-丁醇處理下的小麥幼芽和1、10 mg·L-13-甲基-1-丁醇處理下的玉米幼芽，其總?cè)~綠素均較對照組顯著提高(P<0.05)。其中，1 mg·L-13-甲基-1-丁醇處理的小麥幼芽，其總?cè)~綠素含量(18.16 mg·g-1FW)比對照組提高了8.20%；1 mg·L-13-甲基-1-丁醇處理的玉米幼芽總?cè)~綠素含量(22.27 mg·g-1FW)比對照組提高了23.83%；10 mg·L-13-甲基-1-丁醇處理的玉米幼芽，其總?cè)~綠素含量(17.98 mg·g-1FW)比對照組提高了26.25%。

圖4 不同濃度的3-甲基-1-丁醇對的小麥和玉米種子胚芽總?cè)~綠素含量的影響Fig.4 Effects of 3-methyl-1-butanol in different contents on total chlorophyll content of maize and wheat germ

3 討論

植物和它們的種子在生長過程中獲得了多種適應(yīng)環(huán)境的能力。除了對生存必要的元素：水、氧氣、光、養(yǎng)分以及適宜的溫度外，植物對常由PGPF和PGPR產(chǎn)生的揮發(fā)物信號分子也很敏感[18]：這些揮發(fā)性信號分子能影響種子的萌發(fā)、植物根、莖等的生長。本文對常見的微生物揮發(fā)性信號分子-3-甲基-1-丁醇對小麥和玉米種子萌發(fā)的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：低濃度(1 mg·L-1)的3-甲基-1-丁醇處理可以促進(jìn)小麥和玉米種子萌發(fā)，顯著提高發(fā)芽種子的活力指數(shù)。這一結(jié)果與Novero等[14]研究結(jié)論-1.3 mg·L-1的3-甲基-1-丁醇對種子的形態(tài)和萌芽狀況無顯著影響相比，略有差別。對可溶性糖和可溶性蛋白的生化測定結(jié)果顯示：在1 mg·L-1的3-甲基-1-丁醇處理下兩種受試作物的可溶性糖和蛋白質(zhì)的含量都是各組最低的。這可能是由于1 mg·L-1處理下，受試作物種子將可溶性糖和蛋白質(zhì)更多的轉(zhuǎn)化成了其他的生長過程中需要的因子。相反，100 mg·L-1處理下的種子某種程度上生長受阻、糖和蛋白的轉(zhuǎn)化受阻，于是導(dǎo)致了該處理下，種子內(nèi)可溶性糖和蛋白的積聚。與此相適應(yīng)的是，1和10 mg·L-1處理下的受試作物種芽總?cè)~綠素含量以及抗氧化酶SOD活力均呈較高的水平。上述研究結(jié)果表明：3-甲基-1-丁醇作為介導(dǎo)微生物—植物相互作用的分子，在適宜的濃度下能促進(jìn)小麥和玉米種子萌發(fā)。盡管本文僅做了實(shí)驗(yàn)室研究，但3-甲基-1-丁醇作為一種類激素化學(xué)信號分子體現(xiàn)極大的潛在價(jià)值，對其進(jìn)行深入研究后可望用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐，以達(dá)到作物增產(chǎn)的目的。