劉建新 歐曉彬 劉秀麗 王金成

(1.甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室,慶陽 745000； 2.隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,慶陽 745000)

裸燕麥(AvenanudaL.)為起源于中國的禾本科(Gramineae)裸燕麥屬(Avena)一年生草本植物，在植物學(xué)分類上是一個獨立的物種[1]，具有喜陰涼、耐鹽抗旱和生長期短的生物學(xué)特性。裸燕麥籽粒營養(yǎng)價值高，必需氨基酸組成平衡，是我國西北、西南和華北等省區(qū)廣泛種植的一種小雜糧作物，年種植面積約1 600萬hm2[2]。裸燕麥喜涼爽但不耐寒，幼苗能忍受-4～-2℃的低溫。我國北方常見的倒春寒氣候是影響該區(qū)裸燕麥幼苗生長發(fā)育的重要制約因素。因此，探索提高裸燕麥耐冷性的技術(shù)措施對其高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培具有重要意義。

過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)是生物細胞代謝過程中產(chǎn)生的一種活性氧(reactive oxygen species,ROS)，高濃度時對細胞具有毒害作用，但低濃度的H2O2是植物應(yīng)答多種逆境響應(yīng)的信號分子，它能夠增強植物對逆境的適應(yīng)能力[3]。近年來，關(guān)于H2O2提高植物抗冷性方面的作用研究備受關(guān)注。研究表明，H2O2作為信號分子促進低溫層積下細枝巖黃耆(Hedysarumscoparium)種子的萌發(fā)[4]，誘導(dǎo)香蕉(Musanana)果實采后的抗冷性[5]。外源H2O2處理能夠緩解低溫對柑橘(Citrusreticulata)葉片細胞膜的傷害[6]，增強水稻(Oryzasativa)幼苗的抗寒性[7]，提高綠豆(Vignaradiata)幼苗[8]和直播油菜(Brassicacampestris)苗期[9]耐低溫脅迫的能力，減輕低溫脅迫對結(jié)縷草(Zoysiajaponica)和細葉結(jié)縷草(Zoysiatenuifolia)的氧化傷害[10]。低溫導(dǎo)致植物生長受抑和細胞質(zhì)膜發(fā)生氧化損傷[11]，而抗氧化防御系統(tǒng)和滲透溶質(zhì)積累與植物抵御低溫傷害密切相關(guān)[12]。外源H2O2能夠提高低溫脅迫下油菜種子萌發(fā)過程和幼苗葉片中的抗氧化酶活性和非酶抗氧化物質(zhì)含量，降低ROS積累引發(fā)的膜脂氧化損傷[13～14]，緩解低溫對油菜苗期生長的抑制效應(yīng)[9]，提高低溫脅迫香蕉(Musanana)幼苗可溶性糖的含量[15]，從而增強其耐低溫的能力。然而，這些研究以多個單項指標(biāo)的變化來分析H2O2對植物耐冷性的影響，其評價存在片面性。主成分和隸屬函數(shù)分析提供了一種多指標(biāo)綜合評價的方法，能夠客觀和全面地對植物抗逆性進行評價[16～17]。為明確H2O2對甘肅省主栽裸燕麥新品種‘定莜6號’耐冷性是否具有提升作用，本試驗采用珍珠巖沙培幼苗，通過葉面噴施H2O2預(yù)處理后模擬甘肅中部裸燕麥種植區(qū)常年多出現(xiàn)的低溫條件8℃/5℃(晝/夜)進行低溫脅迫處理，觀察幼苗生長狀況并檢測葉片中活性氧代謝和滲透溶質(zhì)積累的變化，通過主成分和隸屬函數(shù)分析綜合評價H2O2對裸燕麥幼苗耐冷性的影響，以期為應(yīng)用H2O2減輕裸燕麥低溫脅迫傷害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

精選飽滿一致的‘定莜6號’裸燕麥種子經(jīng)3% NaClO表面消毒15 min后用自來水沖洗、風(fēng)干，均勻擺放約200粒種子于鋪有薄層珍珠巖的直徑12 cm培養(yǎng)皿中，然后再用珍珠巖覆滿培養(yǎng)皿，加10 mL自來水后蓋上培養(yǎng)皿蓋在人工氣候箱中25℃/16℃(晝/夜)萌發(fā)，培養(yǎng)皿共180個，每天補充適量自來水以滿足萌芽和生長需要，幼苗2葉1心期澆1次Hoagland營養(yǎng)液，幼苗培養(yǎng)至3葉期時進行低溫處理。人工氣候箱濕度為60%～70%，光照強度400 μmol·m-2·s-1，晝/夜光周期為14 h/10 h。所用30% H2O2分析純?yōu)樯虾Ｉ徆谏锘び邢薰井a(chǎn)品。

1.2 試驗設(shè)計

將180個培養(yǎng)皿中用珍珠巖培養(yǎng)的3葉期裸燕麥幼苗每皿澆10 mL Hoagland營養(yǎng)液后分成兩組，每組90個，一組葉面噴施蒸餾水作為對照(CK)，另一組噴施10 μmol·L-1H2O2(為預(yù)實驗中根據(jù)膜脂過氧化產(chǎn)物變化篩選的適宜濃度)。為降低表面張力，噴施液中加3滴吐溫-80。噴施量以滴液為限，每皿約5 mL。噴施每4 h進行1次，共噴2次，噴施結(jié)束后先在正常溫度(晝/夜25℃/16℃)下培養(yǎng)12 h以使H2O2被葉片充分吸收，然后轉(zhuǎn)入晝/夜為8℃/5℃的人工氣候箱中進行低溫脅迫，光照度400 μmol·m-2·s-1、相對濕度60%～70%，光周期14 h/10 h(晝/夜)。處理期間每天向每個培養(yǎng)皿內(nèi)補充5 mL Hoagland營養(yǎng)液。分別在低溫處理的第0、1、2、3、4、5 d取幼苗葉片，用液氮速凍后-70℃保存，用于測定相關(guān)生理指標(biāo)。低溫處理5 d后測定植株株高和生物量增量。每組處理3次重復(fù)，隨機排列，每天交換在氣候箱中的位置以保證光照條件的一致。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 株高和生物量增量

株高增量Δh(cm)=低溫脅迫5 d后株高(h2)-低溫脅迫前株高(h1)。分別于低溫脅迫前和低溫脅迫5 d后取100株幼苗，洗凈并吸干表面水分后，在105℃殺青30 min后，70℃下烘至恒重，電子天平稱重。生物量增量△m(g)=低溫脅迫5 d天后生物量(m2)-低溫脅迫前生物量(m1)。

1.3.2 活性氧和膜脂過氧化產(chǎn)物

1.3.3 抗氧化系統(tǒng)活性

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性及抗壞血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量測定均采用陳建勛和王曉峰[21]的方法。

1.3.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

按李合生[20]的方法測定可溶性糖和脯氨酸含量；用曾韶西等[22]的方法測定可溶性蛋白質(zhì)和熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

13項生理指標(biāo)測定均重復(fù)3次，結(jié)果以每克鮮重材料為基礎(chǔ)計算。為了綜合評價H2O2對低溫脅迫裸燕麥幼苗生理特性的影響，首先對各指標(biāo)原始數(shù)據(jù)按公式(1)離差標(biāo)準(zhǔn)化，然后進行主成分分析提取4個主成分因子，將4個主成分的得分系數(shù)乘以各自標(biāo)準(zhǔn)化的原始變量求和得到各處理的綜合指標(biāo)值[16]，根據(jù)公式(2)計算各處理綜合指標(biāo)值的隸屬函數(shù)值U(Xj)，按公式(3)計算得到4個綜合指標(biāo)的權(quán)重Wj分別為0.493、0.241、0.144、0.122，再根據(jù)公式(4)計算各處理的隸屬函數(shù)綜合評價值D。各單項指標(biāo)和隸屬函數(shù)綜合評價值均采用SPSS20.0軟件單因素方差分析和Duncan法多重比較(P<0.05)。

(1)

U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中：Xj表示第j個綜合指標(biāo)；Xmin表示第j個綜合指標(biāo)的最小值；Xmax表示第j個綜合指標(biāo)的最大值。

Wj=Pj/∑Pj

(3)

式中：Wj表示第j個綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度；Pj為各處理組第j個綜合指標(biāo)的貢獻率。

D=∑[U(Xj)×Wj]

(4)

式中：D值越大，植株耐低溫的能力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2對低溫脅迫下裸燕麥幼苗生長的影響

從圖1可見，與CK相比，H2O2處理顯著提高了裸燕麥幼苗在低溫脅迫下的株高增量和生物量增量，增幅分別為33.3%和30.1%。

圖1 H2O2對低溫脅迫裸燕麥株高和生物量增量的影響Fig.1 Effect of H2O2 on the height increment and biomass increment of naked oat seedlings under low temperature stress

圖2 H2O2對低溫脅迫下裸燕麥幼苗葉片和MDA含量的影響 不同字母表示處理間5%水平差異顯著，下同。Fig.2 Effect of H2O2 on the contents of and MDA in leaves of naked oat seedlings under low temperature stress The different letters in the figure indicate significant differences at P<0.05,the same as below.

2.2 H2O2對低溫脅迫下裸燕麥幼苗葉片和MDA含量的影響

2.3 H2O2對低溫脅迫下裸燕麥幼苗葉片SOD、CAT、POD、APX活性及AsA和GSH含量的影響

圖3顯示，隨著低溫脅迫時間的延長，H2O2處理的裸燕麥葉片SOD活性呈降——升——降——升變化，CAT活性不斷提高，POD活性和AsA含量先升后降，APX活性呈降——升——降變化，GSH含量呈升——降——升——降波峰變化；而CK裸燕麥葉片SOD活性和GSH含量呈升——降——升趨勢，CAT活性逐漸增加，POD活性和AsA含量呈先升后降變化，APX活性迅速下降后保持穩(wěn)定。與CK相比，H2O2處理的裸燕麥葉片SOD活性除低溫脅迫第2和3 d差異不明顯外，低溫脅迫第0、1、4、5 d的SOD活性明顯升高，增幅為19.7%～312.6%；CAT活性除低溫脅迫第2和4 d時兩處理無明顯差異外，其余低溫脅迫時間均H2O2處理顯著高于CK，增幅為9.1%～35.7%；POD活性在低溫脅迫第1 d時H2O2處理與CK差異不顯著，其它低溫脅迫時間均H2O2處理顯著高于CK，增幅為40.5%～123.7%；APX活性在低溫脅迫第1、4和5 d時H2O2處理與CK相比變化不大，低溫脅迫第0 d時H2O2處理的APX活性明顯下降，而在低溫脅迫第2和3 d時H2O2處理的APX活性顯著高于CK，增幅為12.9%～23.4%；AsA含量在低溫脅迫第1～3 d H2O2處理與CK差異不明顯，低溫脅迫第3～5 d H2O2處理明顯高于CK，增幅達36.0%～64.8%；GSH含量在整個低溫脅迫的第0～5 d H2O2處理均顯著高于CK，增幅為38.2%～257.6%。

2.4 H2O2對低溫脅迫下裸燕麥幼苗葉片可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)和熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)含量的影響

從圖4可以看出，隨著低溫脅迫時間的延長，CK和H2O2處理的裸燕麥葉片可溶性糖和脯氨酸含量逐漸提高，可溶性蛋白質(zhì)和熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)含

圖3 H2O2對低溫脅迫下裸燕麥幼苗葉片SOD、CAT、POD、APX活性及AsA和GSH含量的影響Fig.3 Effect of H2O2 on the SOD,CAT,POD and APX activities and AsA, GSH contents in leaves of naked oat seedlings under low temperature stress

Table1Eigenvalue,variancecontributionandcumulativevariancecontributionofprincipalcomponentanalysisofphysiologicalindicatorinnakedoatseedlingleaves

成分Component12345678910111213特征值Eigen value5.482.691.601.360.650.550.320.230.060.030.020.010.00貢獻率Variance contribution(%)42.1920.6612.3210.444.974.202.481.740.460.260.130.110.03累積貢獻率Cumulative variance contribution(%)42.262.875.285.690.694.897.399.099.599.799.9100.0100.0

圖4 H2O2對低溫脅迫下裸燕麥幼苗葉片可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)和熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of H2O2 on the contents of soluble sugar,proline,soluble protein and heat stable protein in leaves of naked oat seedlings under low temperature stress

量不斷增加，低溫脅迫第5 d時轉(zhuǎn)而下降，但仍高于低溫脅迫第0 d的含量。與CK相比，H2O2處理的裸燕麥葉片可溶性糖含量除低溫脅迫第0和3 d差異不顯著外，其它低溫脅迫時間H2O2處理均高于CK，增幅為15.6%～35.0%；H2O2處理的裸燕麥葉片脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量在整個低溫脅迫的第1～5 d均高于CK，增幅分別為15.3%～63.7%和4.7%～22.2%；熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)含量在低溫脅迫第0～3 d H2O2處理與CK差異不明顯，低溫脅迫第4～5 d H2O2處理明顯高于CK，增幅達5.2%～9.4%。

2.5 H2O2緩解裸燕麥幼苗低溫脅迫的主成分分析和隸屬函數(shù)綜合評價

從4個主成分計算所得的各處理隸屬函數(shù)綜合評價值D如圖5所示：無論是H2O2處理還是未經(jīng)H2O2處理的CK，裸燕麥幼苗耐低溫的綜合評價值D均隨低溫脅迫時間延長顯著提高；但與CK相比，H2O2處理的裸燕麥幼苗在低溫脅迫5 d內(nèi)的D值均顯著高于CK。

圖5 H2O2處理對低溫脅迫裸燕麥幼苗綜合評價值D的影響Fig.5 Effect of H2O2 on comprehensive score(D) of naked oat seedlings under low temperature stress

3 討論

3.1 H2O2對低溫脅迫下裸燕麥幼苗葉片活性氧代謝的影響

3.2 H2O2對低溫脅迫下裸燕麥幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和生長量的影響

低溫脅迫下，胞質(zhì)會趨向積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持細胞膨壓，緩解脅迫對植物的傷害[22～23]。可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)是植物細胞重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[27]。前人研究表明，外施H2O2能夠提高低溫脅迫下黃瓜幼苗可溶性蛋白質(zhì)[28]、香蕉可溶性糖[15]含量，緩解低溫對細胞的傷害。本試驗表明，在低溫脅迫的0～5 d內(nèi)，外源H2O2總體上顯著提高了裸燕麥幼苗葉片可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)和熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)含量(圖4)，與外源H2O2預(yù)處理能夠增加低溫脅迫下水稻可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸含量[7]的研究結(jié)果一致。細胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的提高，有利于維持或降低細胞滲透勢，維持細胞膨壓，防止細胞過度失水或使冰點下降；同時還可保護蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定細胞器功能和減輕低溫對生物膜結(jié)構(gòu)的破壞。表明外施H2O2可以通過增強滲透溶質(zhì)積累，提高裸燕麥幼苗對低溫的適應(yīng)能力。

生長量是植物在逆境下生理變化的綜合反映，也是植物抗逆能力的直接表現(xiàn)。本試驗結(jié)果表明，與CK相比，外施H2O2顯著提高了裸燕麥幼苗在低溫脅迫下的株高增量和生物量增量(圖1)，這與外源H2O2能夠緩解低溫脅迫對苗期油菜生長抑制[9]的結(jié)果一致。其原因可能與外源H2O2能夠提高低溫脅迫下裸燕麥幼苗抗氧化系統(tǒng)活性(圖3)、減輕低溫誘導(dǎo)的活性氧對膜質(zhì)的氧化傷害(圖2)以及細胞滲透調(diào)節(jié)能力增強(圖4)有關(guān)。說明外源H2O2可以通過調(diào)節(jié)裸燕麥活性氧代謝和滲透溶質(zhì)積累，緩解低溫對裸燕麥生長的抑制效應(yīng)，從而增強其對低溫的耐性。

3.3 H2O2緩解裸燕麥幼苗低溫脅迫傷害的綜合評價

4 結(jié)論

噴施10 μmol·L-1H2O2可顯著提高低溫脅迫下裸燕麥幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)防御能力和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，緩解低溫造成的活性氧積累對細胞膜脂的氧化損傷和幼苗生長抑制。通過主成分分析和隸屬函數(shù)綜合評價表明H2O2能夠增強裸燕麥幼苗的耐冷性。