陳蓉，陳偉，顧炳仁

(1.蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇 蘇州 215104；2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009)

芡實(shí)為睡蓮科植物芡EuryaleferoxSalisb的干燥成熟種仁，具有益腎固精，補(bǔ)脾止瀉，除濕止帶的功能,臨床上用于遺精、尿頻、脾虛久瀉、帶下[1]。芡實(shí)營養(yǎng)價(jià)值高，富含淀粉[2]、蛋白質(zhì)[3]、多糖[4]等物質(zhì)，除了是傳統(tǒng)中藥，如今也廣泛應(yīng)用于各種保健品和食品。由于營養(yǎng)性成分含量高，芡實(shí)在產(chǎn)地加工、貯藏過程中，為達(dá)到防霉、防蟲的目的，?？赡苋藶榈匾肓蚧茄?。

適量的熏蒸能達(dá)到殺菌防蟲的目的，同時(shí)使中藥材看起來更美觀[5]。但過量的熏蒸易導(dǎo)致二氧化硫殘留，既造成環(huán)境污染，又對(duì)人體產(chǎn)生潛在危害[6]。硫熏產(chǎn)生的二氧化硫，與藥材中的水分、無機(jī)元素結(jié)合生成亞硫酸鹽，亞硫酸鹽是危害的源頭，體內(nèi)蓄積過量的亞硫酸鹽嚴(yán)重影響到消化道和呼吸道黏膜，會(huì)加重哮喘患者的病情甚至導(dǎo)致死亡[7]。目前芡實(shí)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，《中國藥典》檢查項(xiàng)僅為水分、灰分、浸出物，而無有害物質(zhì)控制項(xiàng)，對(duì)其進(jìn)行二氧化硫殘留量檢查十分必要。

《中國藥典》2015年版中規(guī)定了山藥、牛膝、粉葛、甘遂、天冬、天麻、天花粉、白及、白芍、白術(shù)、黨參等11味藥材及其飲片中二氧化硫殘留量不得過400 mg·kg-1；其他中藥材及飲片二氧化硫殘留量不得過150 mg·kg-1?！吨袊幍洹?015年版四部附錄通則2331二氧化硫殘留量測(cè)定法，收錄了酸堿滴定法、氣相色譜法、離子色譜法三種方法[8]。酸堿滴定法操作簡(jiǎn)單，易普及，其原理為樣品中亞硫酸鹽在酸性條件下轉(zhuǎn)化為二氧化硫，隨氮?dú)獯等胛掌?，被過氧化氫吸收氧化為硫酸根離子，最后用氫氧化鈉溶液滴定。但對(duì)于部分顏色較深的藥材滴定終點(diǎn)判斷不明顯，易出現(xiàn)假陽性，該法也不適用于金銀花、甘草、山楂等含有機(jī)酸的藥材。氣相色譜法雖然專屬性強(qiáng)、靈敏度高，但需配備氣密針形式的頂空進(jìn)樣裝置，且樣品前處理過程中需要蠟封，操作復(fù)雜，成本較高，不便于推廣使用[9]。離子色譜法專屬性較強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、前處理較簡(jiǎn)便，更適合大批量樣品的檢測(cè)[10-11]。本研究采用鹽酸蒸餾法提取，過氧化氫吸收并氧化，離子色譜法測(cè)定硫酸根離子的含量，以期監(jiān)測(cè)芡實(shí)藥材中的二氧化硫殘留量，保證用藥和飲食安全。

1 儀器與試藥

1.1儀器ICS-5000離子色譜儀，配備陰離子抑制器和電導(dǎo)檢測(cè)器(美國Dionex公司)；Dionex Inopac AS 11-HC陰離子分析柱(250 mm×4 mm)，AG 11-HC保護(hù)柱(50 mm×4 mm)；Sartorius CPA225D電子天平(d=0.1 mg，德國賽多利斯公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司)；Thermo Biofuge primo R高速離心機(jī)(美國Thermo公司)。

1.2試藥30%過氧化氫(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純)；氫氧化鉀(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；亞硫酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；鹽酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純)。硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)示量：1 000 mg·L-1，批號(hào)：13073，購自中國計(jì)量測(cè)試研究院。14批芡實(shí)藥材分別來源于河北安國、廣東肇慶、安徽蕪湖、四川成都、江西武穴、福建莆田、四川中江、湖南益陽、山東菏澤、江蘇蘇州、江蘇寶應(yīng)、江蘇金湖、江蘇建湖、江蘇浦口，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為睡蓮科植物芡EuryaleferoxSalisb的干燥成熟種仁，其中，福建莆田、江蘇蘇州、江蘇寶應(yīng)、江蘇金湖、江蘇建湖、江蘇浦口為蘇芡，其余產(chǎn)地為刺芡。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Dionex Inopac AS 11-HC陰離子分析柱(250 mm×4 mm)；保護(hù)柱：AG 11-HC(50 mm×4 mm)；柱溫：30 ℃；洗脫液：20 mmol·L-1氫氧化鉀溶液(在線淋洗液發(fā)生器)；抑制器電流：60 mA；電導(dǎo)檢測(cè)器溫度：30 ℃；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 取硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水稀釋成制成200、100、50、20、5、1 mg·L-1的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取供試品粉末10 g，精密稱定，置水蒸氣蒸餾裝置(參照《中國藥典》2015年版四部通則2331第三法)的樣品瓶中，加水50 mL，振勻；于100 mL量瓶中加入3%過氧化氫20 mL作為接收液，連接好水蒸氣蒸餾裝置，快速于樣品瓶中加入鹽酸5 mL，立即密封，進(jìn)行水蒸氣蒸餾。至接收瓶中液體接近100 mL時(shí)，停止蒸餾，取下接收瓶。用去離子水稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液。

2.2.3空白溶液 空白溶液為不加供試品，自“加水50 mL”起，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，即得。

2.2.4測(cè)定法 取對(duì)照品溶液、供試品溶液(廣東肇慶)及空白溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明待測(cè)離子與其他離子分離良好，空白不干擾硫酸根離子(二氧化硫)的測(cè)定[12]，見圖1。

注：A為對(duì)照品溶液，B為供試品溶液，C為空白溶液

圖1離子色譜圖

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)將“2.2.1”項(xiàng)下不同濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。分別以硫酸根離子濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

(Y=0.679 1X-0.961 6，r=0.999 9)，硫酸根離子在1.00～200.00 mg·L-1線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4檢出限和定量限根據(jù)峰高以信噪比S/N=3確定檢出限為0.33 mg·L-1，S/N=10確定定量限為1.0 mg·L-1。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下廣東肇慶的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件分別于0、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，其RSD為1.31%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取廣東肇慶樣品6份，每份10 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定峰面積，結(jié)果以二氧化硫/硫酸根離子=0.666 9計(jì)算二氧化硫殘留量，平均含量為137.7 mg·kg-1，RSD為2.1%，說明方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)分別精密稱取已測(cè)得含量的廣東肇慶樣品4、5、6 g，每個(gè)濃度各3份，分別精密加入亞硫酸鈉溶液1.80、1.50、1.20 mL(亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液臨用新配，并用碘量法[13]標(biāo)定，以二氧化硫計(jì)，濃度為0.495 4 g·L-1)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.9樣品測(cè)定取14 批芡實(shí)樣品各約10 g，精密稱定，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定峰面積，扣除空白溶液的響應(yīng)值后，計(jì)算樣品中二氧化硫殘留量，結(jié)果見表2。

2.10聚類分析采用SPSS 18.0，以組間平均法，計(jì)算平方歐氏距離，對(duì)14個(gè)產(chǎn)地樣品進(jìn)行聚類分析，得到不同樣品的聚類圖。14個(gè)產(chǎn)地樣品被聚為四類，結(jié)果見圖2。

表2 芡實(shí)中二氧化硫殘留量

圖2 不同產(chǎn)地芡實(shí)二氧化硫殘留量聚類結(jié)果

第一類包括6個(gè)產(chǎn)地(S6、S10、S11、S12、S13、S14)，分別為江蘇蘇州、江蘇寶應(yīng)、江蘇金湖、江蘇建湖、江蘇浦口、福建莆田，這一類產(chǎn)地芡實(shí)中二氧化硫殘留量最低，不超過20 mg·kg-1。江蘇和福建莆田芡實(shí)品種為果皮不帶刺的蘇芡，以食用為主，藥用為輔[14]。其中江蘇蘇州的殘留量最低，可能與蘇州地區(qū)芡實(shí)主要作為時(shí)令水生蔬菜，以鮮品供食用有關(guān)，無需硫熏儲(chǔ)存。

第二類包括4個(gè)產(chǎn)地(S3、S5、S7、S8)，分別為安徽蕪湖、江西九江、四川中江、湖南益陽，這些產(chǎn)地均在長江流域，水資源豐富地區(qū)，二氧化硫殘留量均不超過70 mg·kg-1。

第三類包括2個(gè)產(chǎn)地(S4、S9)，分別為四川成都、山東菏澤，這一類產(chǎn)地二氧化硫殘留量均超過100 mg·kg-1，可能與成都?xì)夂驖駶櫍蜓瑸榉烂棺冇嘘P(guān)。

第四類包括2個(gè)產(chǎn)地(S1、S2)，分別為河北安國、廣東肇慶，這一類產(chǎn)地二氧化硫殘留量均超過120 mg·kg-1，遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)地，可能與河北安國是藥材流通市場(chǎng)，硫熏能增強(qiáng)藥材外觀和貯存時(shí)間；廣東肇慶是刺芡主產(chǎn)區(qū)，是藥用芡實(shí)的主要來源，硫熏能增強(qiáng)產(chǎn)地加工的效果有關(guān)。

聚類結(jié)果顯示，芡實(shí)藥材中二氧化硫殘留量有明顯的產(chǎn)地差異，基本以蘇芡量最少，長江流域次之，而刺芡中殘留量最大，可能與產(chǎn)地氣候、環(huán)境以及產(chǎn)品用途有關(guān)。故產(chǎn)地從一定程度上可以反應(yīng)藥材的硫熏情況。

3 討論

各產(chǎn)地芡實(shí)藥材均存在一定程度的二氧化硫殘留，食用芡實(shí)較藥用芡實(shí)安全性高，因此建議藥材產(chǎn)地加工選用更為合理的熏制工藝，盡量減少二氧化硫在芡實(shí)中的殘留，以保證藥物安全。本研究采用的離子色譜法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，準(zhǔn)確度較高，適合芡實(shí)中二氧化硫殘留檢測(cè)，可為芡實(shí)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高作一參考，也可為食品工業(yè)原料質(zhì)控提供依據(jù)。

國際上對(duì)此已有相關(guān)限度要求。FAO/WHO及食品添加劑專家委員會(huì)(JECFA)認(rèn)為：二氧化硫的成人攝入量每日不得超過0.7 mg·kg-1[15]。韓國食品醫(yī)藥品安全廳對(duì)中藥材中二氧化硫的限量值規(guī)定為30 mg·kg-1[16]。國內(nèi)外食品領(lǐng)域中的限量值多在30～100 mg·kg-1[17-18]。因此，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果及上述標(biāo)準(zhǔn)，并參考我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，芡實(shí)中二氧化硫限量可暫定為150 mg·kg-1[19]。

此外需要注意的是，二氧化硫的殘留量會(huì)隨時(shí)間推移而變化，同時(shí)不同提取方法和測(cè)定手段得到的結(jié)果會(huì)有較大的差異[20]，如滴定法人為因素影響大，準(zhǔn)確度較低。離子色譜法相對(duì)靈敏度較高，蒸餾處理的樣品較為潔凈，但蒸餾速度太快，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏差較大，因此實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)保證相對(duì)穩(wěn)定。