黃萃園，張洪，白瑞丹

(武漢大學人民醫(yī)院藥學部，湖北 武漢 430060)

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是一種能夠識別病原相關模式分子和危險相關模式分子的受體[1]，分布于各個細胞的表面，參與生物體內的各種炎癥調節(jié)、免疫應答以及腫瘤發(fā)生的進程。而在體內經(jīng)配體刺激后，TLR4主要通過2條信號通路參與調控疾病的發(fā)生和發(fā)展，一條是髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴性信號轉導通路，可進一步激活核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，從而導致前炎性細胞因子的表達；另一條是為非MyD88依賴性通路，可激活轉錄因子干擾素調節(jié)因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)和NF-κB，調節(jié)干擾素相關基因的轉錄。研究表明TLR4信號通路與肝癌[2]、結直腸癌[3]、胃癌[4]、宮頸癌[5]以及心血管疾病[6]等密切相關。TLR4基因位于9號染色體，其單核苷酸的多態(tài)性(SNP)可能會對某些疾病的易感性及發(fā)展程度產(chǎn)生影響。而研究較多的是2個位于外顯子區(qū)的單個核苷酸的變異：896 A>G(rs4986790)、1196 C>T(rs4986791)；該區(qū)域的變異會導致TLR4蛋白表面性質的改變，從而影響TLR4與配體的結合[7]。臨床研究[8-9]發(fā)現(xiàn)896 A>G、1196 C>T位點多態(tài)性與丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)易感性有關，同時與肝硬化患者的發(fā)展程度以及肝癌發(fā)生發(fā)展有關，但相關機制尚未闡明。因此，本課題擬通過構建含有TLR4 1196C/T、896A/G野生型、突變型基因的真核表達系統(tǒng)載體，并將其轉染HepG2細胞后加入嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達TLR4的細胞株，為體外研究TLR4基因多態(tài)性對HepG2細胞生物學功能的影響及肝癌發(fā)展影響的分子機制提供重要的實驗基礎。本研究起止時間為2016年10月至2017年2月。

1 材料與方法

1.1質粒及菌株pIRES2-ZsGreen1載體，感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自武漢巴菲爾生物技術服務有限公司。

1.2試劑及儀器Taq DNA Polymerase(TIANGEN,批號:ET105-02-01)，dNTP (TIANGEN,批號:CD117)，pfu DNA(PolymeraseFermentas,批號:EP0572)DpnI (Fermentas,批號:ER1702)，DL15000(TIANGEN,批號:MD110)，DL2000(TIANGEN,貨號:MD114)，金牌超量無內毒素質粒大提試劑盒(康為世紀,批號:CW2104)，PCR擴增儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)，水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)，紫外分析儀(北京君意東方電泳設備有限公司)，Western blot試劑盒(武漢谷歌生物有限公司)，TLR4一抗(Affinity Biosciences，批號:AF7017)，羊抗兔二抗(cell signaling technology，批號:5151)。

1.3方法

1.3.1重組質粒的構建 在NCBI基因庫中查找的人類TLR4基因序列并依照引物設計原則設計引物，PCR擴增合成cDNA。雙酶切連接至pIRES2-ZsGreen1 載體的 Xho I 和 BamH I 之間，獲得重組質粒pIRES2-TLR4。

1.3.2單突變質粒的構建 質粒pIRES2-TLR4，896位點由A突變?yōu)镚，突變后質粒命名為pIRES2-TLR4(A-G)；質粒pIRES2-TLR4，1196位點由C突變?yōu)門，突變后質粒命名為pIRES2-TLR4(C-T)。引物設計:TLR4-F(A-G):CTACCTCGATGGTATTATTGACTTATTTAATTGTTTGACA；TLR4-R(A-G):AAT-AAGTCAATAATACCATCGAGGTAGTAGTCTAAGTA-TG；TLR4-F(C-T):GATTTTGGGACAATCAGCCTAAAGTATTTAGATCTGAG；TLR4-R(C-T):TA-CTTTAGGCTGATTGTCCCAAAATCACTTTGAGAAC。反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，68 ℃ 12 min，18個循環(huán)；72 ℃ 30 min，4 ℃ 10 min，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將PCR產(chǎn)物用Dpn I酶切并將酶切產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，加入卡那霉素進行篩選。以載體pIRES2-ZsGreen1的通用引物CMV-F和IRES-R進行PCR鑒定。擴增片段約為2 600 bp。引物序列如下：CMV-F：CGCAAATGGGCGG-TAGGCGTG；IRES-R：CCTCACATTGCCAAAAGACG。

1.3.3雙突變質粒的構建 以pIRES2-TLR4(A-G)為模板，以TLR4-F(C-T)，TLR4-R(C-T)為引物進行PCR擴增構建雙突變質粒，質粒命名為pIRES2-TLR4(A-G，C-T)。反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，68 ℃ 12 min，18個循環(huán)；72 ℃ 30 min，4 ℃ 10 min。 用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將PCR產(chǎn)物用Dpn I酶切并將酶切產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，加入卡那霉素進行篩選。以載體pIRES2-ZsGreen1的通用引物CMV-F和IRES-R進行PCR鑒定。擴增片段約為2 600 bp。

1.3.4載體亞克隆 載體質粒pLVX-IRES-Puro和目的基因質粒pIRES2-TLR4的XhoI和BamHI 雙酶切，酶切反應在37 ℃水浴反應3 h。分別回收載體pLVX-IRES-Puro酶切大片段和目的基因質粒pIRES2-TLR4酶切小片段。質粒pLVX-IRES-Puro XhoI+BamHI回收大片段與目的基因TLR4的連接，連接反應在22 ℃反應3 h。將連接產(chǎn)物轉化JM109感受態(tài)細菌，用氨芐西林進行篩選后，用小量質粒抽提試劑盒抽提質粒，進行酶切鑒定。得到質粒pLVX-TLR4-Puro、pLVX-TLR4(A-G)-Puro、pLVX-TLR4(C-T)-Puro、pLVX-TLR4(A-G，C-T)-Puro。

1.3.5質粒轉染及構建穩(wěn)轉細胞株 病毒感染前1 d 鋪HepG2細胞于24孔細胞培養(yǎng)板，感染當日細胞匯合度30%～60%為宜；取10 μL病毒液加入24孔板之細胞表面，細胞培養(yǎng)箱中孵育至少2 h后換液(也可不換液)；感染48 h后可檢測到空載對照組GFP的表達(熒光顯微鏡鏡檢)；病毒感染后24 h，可以換用含最優(yōu)濃度(本次篩選的最佳濃度為0.2 mg·L-1)嘌呤霉素的培養(yǎng)基。以后每隔1 d換用新鮮含嘌呤霉素的無抗生素3%～5%血清培養(yǎng)基，以替換含大量死細胞的培養(yǎng)基。直到抗性群落能被識別出。待抗性細胞長滿以后，進行傳代，用含0.02% EDTA的胰酶消化約2 min，用含血清的完全培養(yǎng)液終止消化，離心后棄上清，加入含10%的胎牛血清、100 μ·mL-1青霉素和100 μ·mL-1鏈霉素RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，按適當比例接種6孔板進行實驗。

1.3.6Western blot檢測TLR4蛋白表達水平 分別在6孔板中接種HepG2正常細胞、轉染TLR4野生型及突變型基因的HepG2細胞，每孔約3×105個細胞，24 h后收集細胞加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，并用BCA法測定蛋白含量。將5×上樣緩沖液與提取的蛋白樣品按照1 ∶4的比例進行混合，煮沸10 min使蛋白變性。在8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再電轉至PVDF膜上。電轉后用BSA封閉2 h，分別用一抗TLR4和GAPDH于4 ℃孵育過夜。洗滌緩沖液(TBST)洗膜3次，再于羊抗兔二抗中避光孵育2 h，在奧德賽雙色紅外激光成像系統(tǒng)進行掃描分析。

2 結果

2.1TLR4單突變及雙突變型重組質粒構建設計引物構建單突變質粒，PCR反應后進行1%瓊脂糖凝膠電泳。酶切產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞，挑取單個菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，以載體pIRES2-ZsGreen1的通用引物CMV-F和IRES-R進行PCR鑒定，擴增片段約為2 600 bp，結果如圖1(分別挑取了2個菌落)。PCR結果正確，進行測序鑒定。測序結果比對后正確，pIRES2-TLR4(A-G)，pIRES2-TLR4(C-T)構建成功。 以pIRES2-TLR4(A-G)為模板，以TLR4-F(C-T)，TLR4-R(C-T)為引物進行PCR擴增構建雙突變質粒后進行1%瓊脂糖凝膠電泳。同樣，以通用引物CMV-F和IRES-R進行PCR鑒定，擴增片段約為2 600 bp，結果如圖2(挑取了2個菌落)。PCR結果正確，送pIRES2-TLR4(A-G，C-T)-1測序，測序結果比對后正確，pIRES2-TLR4(A-G，C-T)構建成功。

注：M為DL2000;1為pIRES2-TLR4(A-G)-1；2為pIRES2-TLR4(A-G)-2；3為pIRES2-TLR4(C-T)-1；4為pIRES2-TLR4(C-T)-2

圖1單突變質粒PCR鑒定圖

注：M為DL2000; 1為pIRES2-TLR4(A-G，C-T)-1；2為pIRES2-TLR4(A-G，C-T)-2

圖2雙突變質粒PCR鑒定圖

2.2pLVX-TLR4-Puro質粒構建載體質粒pLVX-IRES-Puro和目的基因質粒pIRES2-TLR4用XhoI和BamHI 雙酶切，回收片段進行連接反應、轉化后，各挑取4個單菌落抽提質粒進行酶切鑒定，結果如圖3所示。經(jīng)質粒酶切鑒定結果表明，5#、8#、11#、10#克隆為陽性克隆。進行測序后，經(jīng)BLAST比對結果表明質粒pLVX-TLR4-Puro-5#、pLVX-TLR4(A-G)-Puro-8#、pLVX-TLR4 (C-T) -Puro-11#、pLVX-TLR4(A-G，C-T)-Puro-10#測序結果與設計序列一致。

注：Lane M為Trans2K plus marker

圖3pLVX-TLR4-Puro質粒酶切鑒定

2.3單克隆細胞篩選結果HepG2細胞分別轉染重組質粒pLVX-TLR4-Puro、pLVX-TLR4(A-G)-Puro、pLVX-TLR4(C-T)-Puro、pLVX-TLR4(A-G，C-T)-Puro，經(jīng)細胞克隆后，用嘌呤霉素進行篩選，分別在加藥48 h后于倒置顯微鏡下觀察，4組細胞均生長較好、形態(tài)正常，如圖4。

2.4Westernblot檢測TLR4蛋白表達水平以GAPDH蛋白為內參，檢測HepG2正常細胞(對照組)及4組重組TLR4過表達細胞(WT野生型；1196位點單突變型；896位點單突變型；1196、896位點雙突變型)中TLR4蛋白的表達水平，結果表明4組轉染了TLR4基因的HepG2細胞中TLR4蛋白表達量顯著高于正常HepG2細胞(圖5)。

注：1為TLR4-WT；2為TLR4-1196T；3為TLR4-896G；4為TLR4-1196T，896G；5為對照組；與正常HepG2細胞相比，aP<0.01

圖5Westernblot檢測各組細胞中TLR4蛋白表達水平(n=3)

3 討論

肝癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，死亡率極高且發(fā)病率逐年上升[10]。TLR4對肝癌細胞的增殖、凋亡及侵襲等生物學功能有重要的影響[11-12]。TLR4信號通路參與肝癌發(fā)生發(fā)展主要通過MyD88依賴以及非MyD88依賴信號途徑激活NF-κB和活化激活蛋白1(AP-1)等轉錄因子，從而促進炎癥因子釋放，刺激肝實質細胞、間質細胞，引起細胞突變以及活化相關免疫細胞，誘導肝癌的發(fā)生[13-14]。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的多因素過程，其復發(fā)率高使得治療效果難以令人滿意。

隨著藥物基因組學的發(fā)展，基因多態(tài)性和開展個體化治療已成為當代的熱點，研究肝癌發(fā)展影響的分子機制對評價環(huán)境危險因素以及設計個體化治療方案具有重要的實際應用價值。肝炎病毒是肝硬化和肝癌形成的重要原因，而臨床研究[15]表明896A及1196C在HCV 患者組的基因頻率分布要遠遠高于正常組，896G及1196T可以作為防止HCV感染的保護因素。同時，Guarner-Argente 等[9]發(fā)現(xiàn)TLR4基因多態(tài)性不僅與HCV 易感性有關，還與肝硬化患者的發(fā)展程度有關，可用來預測HCV 引起的慢性肝病臨床進展以及患肝癌的風險性。因此，研究TLR4基因多態(tài)性對肝癌發(fā)展影響的分子機制具有重要意義。

本實驗通過構建TLR4-WT(野生型)、896A/G、1196C/T單突變及雙突變重組質粒轉染肝癌細胞HepG2，使TLR4蛋白在4組HepG2細胞中穩(wěn)定的過表達。由于轉染的質粒不同(野生或突變型)，可能會導致TLR4表達的含量或蛋白的結構功能發(fā)生變化，從而影響HepG2細胞增殖、凋亡及侵襲等生物學功能的變化。同時，本實驗采用穩(wěn)定轉染的方法，用嘌呤霉素篩選掉沒有被成功轉染的細胞，使4組細胞的轉染率為100%，排除由于轉染率的不同而導致導致TLR4表達含量或功能的變化。由于4組HepG2細胞除了穩(wěn)定轉染的質粒不同，其他生理、各種環(huán)境條件均相同，若進一步實驗表明4組HepG2細胞的生物學功能不同，而影響因素極有可能是轉染不同的質粒后，過表達的TLR4的含量或結構功能改變，因此可初步研究TLR4基因的多態(tài)性對肝癌發(fā)展的影響。雖然HepG2細胞本身表達少量TLR4蛋白，但進行穩(wěn)轉的4組細胞原本TLR4含量及功能一致，研究的是4組細胞過表達后產(chǎn)生的不同，同時以未轉染的HepG2細胞作為對照。若要完全排除遺傳背景可能對實驗結果的產(chǎn)生干擾，需要將細胞中TLR4基因敲低或敲除。對HepG2細胞進行TLR4基因敲低或敲除的方法主要是micro RNA和siRNA，但microRNA 和 siRNA轉染率很難在4組細胞中完全保持一致，同時可能會影響后轉入的質粒的表達，因此這種方法的可行性較低。若對動物如小鼠進行TLR4基因敲除，進行造模后取其肝癌細胞，再將這4種質粒(TLR4-WT；TLR4-1196T；TLR4-896G；TLR4-1196T，896G)轉染進行穩(wěn)定表達，研究TLR4基因多態(tài)性對小鼠肝癌細胞生物功能的影響，并與TLR4基因多態(tài)性對人肝癌細胞HepG2生物學功能的影響進行比較，若結果一致則更加嚴謹。因此，這也是本實驗室今后需要深入研究的方向。

最后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖及基因測序結果表明成功合成了2種單突變及雙突變的質粒；pLVX-TLR4-Puro質粒酶切鑒定圖表明亞克隆成功，可進行穩(wěn)定轉染；嘌呤霉素篩選出含有抗性基因的細胞及Westernblot結果表明TLR4重組質粒已經(jīng)轉入細胞，TLR4在HepG2細胞中穩(wěn)定過表達。因此，本實驗室構建的穩(wěn)轉HepG2細胞將為進一步開展肝癌的臨床個體化治療奠定基因。

(本文圖4見插圖9-2)