張瑞萍，劉福壘

(1.洛陽市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 洛陽 471002；2.泰安市中心醫(yī)院，山東 泰安 271000)

心肌重構(gòu)作為心臟在多種心血管疾病后的一種代償性病理過程，是導(dǎo)致患者心力衰竭甚至死亡的重要因素[1]，而心肌纖維化在心肌重構(gòu)中扮演重要角色[2]。因此，如何有效防治心肌纖維化已成為心內(nèi)科研究重點(diǎn)。Klotho作為一種抗衰老基因，在多種生理病理過程中扮演重要角色，Klotho表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致一系列與衰老類似的功能紊亂，如骨質(zhì)疏松、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、免疫功能異常、皮膚衰老等[3]。Corsetti等[4]研究指出，Klotho基因及表達(dá)產(chǎn)物與心血管疾病及其各種危險(xiǎn)因素密切相關(guān)。田倪妮等[5]研究也認(rèn)為，慢性心力衰竭患者心肌組織中Klotho基因表達(dá)減少。本研究通過構(gòu)建大鼠心肌梗死模型，并轉(zhuǎn)導(dǎo)外源性腺病毒重組Klotho基因，觀察其對(duì)心肌梗死大鼠心功能及心肌纖維化的影響，以期為心肌梗死引起心肌纖維化的相關(guān)機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(210±10)g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下，自由飲水、進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前預(yù)適應(yīng)環(huán)境至少7 d。利用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、Klotho轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒組，每組15只。本研究起止時(shí)間為2016年12月至2017年1月，符合一般實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2主要試劑和設(shè)備 慢病毒載體、pDC316-T載體和pDC316-mCMV-EGFP載體質(zhì)粒(美國Stratagene公司)，總RNA提取試劑盒(Trizol法，美國Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒、加A尾試劑盒、EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制酶(日本TaKaRa公司)，2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)， Klotho、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)及內(nèi)參引物序列(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，Klotho兔多克隆抗體和兔抗大鼠TGF-β 多克隆抗體(美國Abcam公司)，兔抗大鼠CTGF 多克隆抗體(美國 SantaCruz公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)，Masson三色染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司)，生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(北京東西儀科技有限公司)，小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

1.2方法

1.2.1Klotho基因重組腺病毒載體構(gòu)建 利用總RNA提取試劑盒(Trizol法)對(duì)大鼠新鮮腎臟組織中總RNA進(jìn)行提取，根據(jù)GeneBank中大鼠Klotho基因序列(收錄號(hào)：NM_021748.1)設(shè)計(jì)Klotho基因特異性引物：上游：5′-GGGAAGCTTGCTGCGCGGGAG-CCAGGCTCCGGGGC-3′，下游：5′-GGCCTCGAGTG-CTAATATATGCTGGCTGGAGTTGG-3′。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以Klotho基因特異性引物下游為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，對(duì)Klotho基因序列進(jìn)行RT-PCR。利用加A尾試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行加A尾后，與pDC316-T載體連接，利用EcoR Ⅰ 和Xho Ⅰ 限制酶進(jìn)行雙酶切，并進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。提取測(cè)序正確的質(zhì)粒，利用EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制酶進(jìn)行雙酶切后，克隆至pDC316-mCMV-EGFP載體質(zhì)粒，在與慢病毒載體混合、同源重組、酶切后，制備攜帶Klotho基因的重組質(zhì)粒。攜帶Klotho基因的重組質(zhì)粒經(jīng)包裝、擴(kuò)增、純化、滴度測(cè)定均由上海閃晶分子生物科技有限公司完成。病毒半數(shù)組織細(xì)胞感染量(TCID50)法測(cè)定出病毒滴度為1.5×1010TU·mL-1。

1.2.2大鼠急性心肌梗死模型制備及處理 參考文獻(xiàn)[6]中結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備大鼠急性心肌梗死模型：利用腹腔注射戊巴比妥鈉的方法將大鼠麻醉后，利用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)大鼠進(jìn)行檢測(cè)。氣管插管后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，開胸后，利用撐胸器使胸腔中心臟充分暴露，利用8-0無創(chuàng)傷絲線合針于肺動(dòng)脈圓錐和主動(dòng)脈交界處以下約2 mm穿過左冠狀動(dòng)脈前降支，并進(jìn)行結(jié)扎，建模成功標(biāo)志：以結(jié)扎線以下心肌顏色變蒼白、波動(dòng)減縮、心電圖示ST段抬高明顯為結(jié)扎成功。假手術(shù)組僅將8-0無創(chuàng)傷絲線穿過左冠狀動(dòng)脈前降支而不結(jié)扎。10 min后，Klotho轉(zhuǎn)染組取200 μL的攜帶Klotho基因的質(zhì)粒，分別于左心室游離壁上、下、左、右四個(gè)部位進(jìn)行局部注射，模型組和空白質(zhì)粒組則分別將等量的生理鹽水和空白質(zhì)粒按照Klotho轉(zhuǎn)染組的方法進(jìn)行局部注射。常規(guī)胸腔滴注利多卡因以防止室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)的發(fā)生，將胸腔積液吸盡后，斷開呼吸機(jī)，負(fù)壓逐層關(guān)胸。待大鼠蘇醒后，拔除氣管插管，同組同籠喂養(yǎng)。術(shù)后3 d連續(xù)腹腔注射青霉素以預(yù)防感染。術(shù)后存活大鼠51只，假手術(shù)組14只、模型組12只、Klotho轉(zhuǎn)染組13只和空白質(zhì)粒組12只。

1.2.3大鼠心功能檢測(cè) 各組14 d后，稱重，利用腹腔注射戊巴比妥鈉的方法將大鼠麻醉后，利用超聲心動(dòng)圖對(duì)大鼠心功能進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)和短軸縮短率(FS)。

1.2.4各組大鼠心肌梗死面積檢測(cè) 各組大鼠完成心功能檢測(cè)后，處死，打開胸腔，取出心臟，用生理鹽水反復(fù)沖洗，將殘留血液洗凈，去除表面結(jié)締組織，放入-80 ℃冰箱凍存15 min，取出后沿心臟縱軸方向從心底向心尖對(duì)左心室切片，厚度約2 mm，置于新配置的TTC溶液中，避光恒溫染色30 min，取出后，PBS沖洗3次，用4%多聚甲醛固定30～40 min，自然光下拍照，梗死區(qū)呈灰白色。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)各組大鼠心肌梗死面積占全部心肌面積比例進(jìn)行分析。

1.2.5各組大鼠心肌組織病理學(xué)和纖維化檢測(cè) 取各組心尖部心肌組織，PBS洗滌后，用4%多聚甲醛過夜固定，石蠟包埋，切片，利用免疫組織化學(xué)染色試劑盒檢測(cè)心肌組織病理學(xué)變化，利用Masson三色染色試劑盒對(duì)間質(zhì)膠原纖維染色，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)間質(zhì)纖維化面積占組織切片總面積的比值進(jìn)行分析。

1.2.6利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF基因表達(dá) 取各組大鼠心尖部心肌組織，研磨后加入細(xì)胞裂解液，用總RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，利用PCR試劑盒進(jìn)行PCR。引物序列分別為：Klotho引物(104 bp)：上游：5′-GCTCTCAAA-GCCCACATACTG-3′，下游：5′-GCAGCATAACGATA-GAGGCC-3′；TGF-β1引物(146 bp)：上游：5′-GGATACCAACTATTGCTTCAGCTCC-3′，下游：5′-AGGCT-CCAAATATAGGGGCAGGGTC-3′；CTGF引物(232 bp)：上游：5′-GCAGCGGTGAGTCCTTCC-3′，下游：5′-AATGTGTCTTCCAGTCGGTAGG-3′；β-actin引物(205 bp)：上游： 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行40次循環(huán)，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法分析各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7利用Western blot法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF蛋白表達(dá) 取各組大鼠心尖部心肌組織，研磨后加入細(xì)胞裂解液，用總蛋白提取試劑盒對(duì)組織中總蛋白進(jìn)行提取，用BCA總蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)獲得的總蛋白進(jìn)行檢測(cè)。取20 μg總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉室溫下封閉60 min，將一抗Klotho兔多克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β和CTGF 多克隆抗體(稀釋比例分別為1 ∶800、1 ∶1 200和1 ∶600)加入，過夜孵育，用TBST沖洗3次，加入二抗，37 ℃條件下孵育4 h，用TBST沖洗3次，加入辣根過氧化物酶底物，暗室下反應(yīng)30 min。拍照，利用圖像分析軟件按半定量法對(duì)各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心功能比較與假手術(shù)組相比，模型組、Klotho轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒組大鼠LVEF和FS均降低，而LVDs和LVDd均升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和空白質(zhì)粒組相比，Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠LVEF和FS均升高，而LVDs和LVDd均降低，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

2.2各組大鼠心肌梗死面積比較TTC染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌梗死面積為0.00%，模型組和空白質(zhì)粒組大鼠心肌梗死面積分別為(39.09±4.66)%和(36.07±3.25)%，兩組均高于Klotho轉(zhuǎn)染組的(24.49±4.30)%，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.195，P<0.001)，詳見圖1。

2.3各組大鼠心肌組織病理學(xué)和纖維化比較HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整，可見細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，以及細(xì)胞間連接，纖維整齊排列；模型組和空白質(zhì)粒組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)不完整，纖維排列稀疏雜亂，肌纖維出現(xiàn)斷裂、間質(zhì)水腫，有大量炎癥細(xì)胞浸潤；Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌病理學(xué)改變較模型組和空白質(zhì)粒組減輕，詳見圖2。

Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞規(guī)整排列，散在分布有少量的藍(lán)色膠原纖維；模型組和空白質(zhì)粒組大鼠心肌細(xì)胞排列雜亂，期間可見大量的藍(lán)色膠原纖維；Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠纖維化改變較模型組和空白質(zhì)粒組減輕，詳見圖3。假手術(shù)組間質(zhì)纖維化面積為(4.75±0.35)%，模型組和空白質(zhì)粒組間質(zhì)纖維化面積均增加，分別為(38.82±2.38)%和(38.50±2.91)%，與模型組和空白質(zhì)粒組相比，Klotho轉(zhuǎn)染組則減少，為(21.88±2.38)%，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=719.697，P<0.001)。

2.4各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF基因表達(dá)比較與假手術(shù)組相比，模型組、空白質(zhì)粒組和Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌組織中Klotho mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，而TGF-β1、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和空白質(zhì)粒組相比，Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌組織中Klotho mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，而TGF-β1、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

2.5各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF蛋白表達(dá)比較與假手術(shù)組相比，模型組、空白質(zhì)粒組和Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌組織中Klotho蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，而TGF-β1、CTGF蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和空白質(zhì)粒組相比，Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌組織中Klotho蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，而TGF-β1、CTGF蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3和圖4。

表1 各組大鼠心功能比較

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與空白質(zhì)粒組相比，cP<0.05

表2 各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF基因表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與空白質(zhì)粒組相比，cP<0.05

表3 各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF蛋白表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與空白質(zhì)粒組相比，cP<0.05

圖4 Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌組織中

3 討論

心肌梗死作為心內(nèi)科常見的危急癥，發(fā)病率居高不下，且近年來呈逐年上升趨勢(shì)，是嚴(yán)重威脅人群生命健康的重要疾病[7]。Talman和Ruskoaho[8]研究表明，心肌纖維化所致心肌重構(gòu)在心肌梗死中扮演重要角色。心肌纖維化是心肌中成纖維細(xì)胞被大量活化，細(xì)胞外基質(zhì)大量產(chǎn)生，是多因素、多基因、多步驟共同作用的結(jié)果[9]。Klotho基因作為重要的抗衰老基因，參與了多種疾病的發(fā)生過程，在心血管疾病患者血漿中呈低表達(dá)[10]，且參與了心血管疾病的相關(guān)危險(xiǎn)因素(如糖尿病、高血壓、血脂異常、腎功能異常等)的發(fā)生[11]。本研究進(jìn)一步探討了Klotho基因在心肌梗死心肌纖維化中的作用，在利用腺病毒重組傳導(dǎo)Klotho基因?qū)Υ笫笮募√幚砗?，PCR和Western blot檢測(cè)均顯示Klotho基因轉(zhuǎn)染組心肌組織中Klotho表達(dá)升高，提示轉(zhuǎn)染成功。

本研究采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備大鼠心肌梗死模型，HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不完整，纖維排列稀疏雜亂，肌纖維出現(xiàn)斷裂、間質(zhì)水腫，有大量炎癥細(xì)胞浸潤；TTC染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌梗死面積顯著增加，這些結(jié)果均提示成功構(gòu)建了大鼠心肌梗死模型。在轉(zhuǎn)導(dǎo)了Klotho基因后，Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌病理學(xué)改變較模型組和空白質(zhì)粒組減輕，且心肌梗死面積縮小，說明上調(diào)Klotho基因表達(dá)可有效減輕結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支對(duì)心肌的損傷作用。心肌重構(gòu)作為心肌梗死后重要的病理學(xué)改變，一方面可通過增加左心室心肌重量及室壁厚度而維持正常的心臟容積及LVEF，同時(shí)，隨著左心室的擴(kuò)張，LVEF會(huì)隨之下降并表現(xiàn)出心力衰竭癥狀[12-13]。本研究顯示，與假手術(shù)組相比，心肌梗死大鼠均出現(xiàn)LVEF和FS降低，而LVDs和LVDd升高，提示心肌梗死導(dǎo)致的心肌重構(gòu)可影響心臟功能。在轉(zhuǎn)導(dǎo)了Klotho基因后，與模型組和空白質(zhì)粒組相比，Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠LVEF和FS均升高，而LVDs和LVDd均降低，說明上調(diào)Klotho基因表達(dá)可有效改善大鼠心臟功能。

心肌纖維化作為心肌梗死后心力衰竭的重要病理基礎(chǔ)，是導(dǎo)致死亡的重要因素[14]，在此過程中，膠原蛋白會(huì)大量地堆積于細(xì)胞之間及血管間隙，使心肌活動(dòng)力下降，心室壁僵硬、收縮及舒張功能受損，心功能不斷下降[15]。本研究Masson染色結(jié)果顯示，模型組和空白質(zhì)粒組大鼠心肌細(xì)胞外堆積了大量藍(lán)染的纖維，間質(zhì)纖維化面積顯著增加，這也是導(dǎo)致大鼠心功能下降的原因，但Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌組織Masson染色藍(lán)色區(qū)域顯著減少，間質(zhì)纖維化面積減少，說明上調(diào)Klotho基因基因表達(dá)可有效減輕心肌纖維化。CTGF作為一種分泌性蛋白，在促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成、加速纖維沉淀及抑制膠原降解中發(fā)揮重要作用，在心力衰竭后心肌纖維化進(jìn)程中呈異常高表達(dá)[16]；TGF-β1是心肌纖維化過程中關(guān)鍵性調(diào)控因子，可促進(jìn)CTGF的表達(dá)，二者在加速心肌重構(gòu)及纖維化過程中發(fā)揮協(xié)同作用[17]。本研究顯示，模型組和空白質(zhì)粒組大鼠心肌組織中TGF-β1、CTGF基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，而Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌組織中TGF-β1、CTGF基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，說明上調(diào)Klotho基因表達(dá)可能通過抑制TGF-β1、CTGF基因表達(dá)而阻斷急性心肌梗死大鼠心肌纖維化進(jìn)程。

綜上所述，利用重組腺病毒載體傳導(dǎo)Klotho基因可有效改善心肌梗死大鼠心功能，減輕心肌纖維化，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1、CTGF基因表達(dá)有關(guān)，有望為心肌梗死臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

(本文圖1～3見插圖9-1)