王美瑤 劉煜敏 李艷 張仁偉 張帥美 封紅亮

缺血性腦卒中在全球范圍內(nèi)具有較高發(fā)病率、致殘率、病死率的特點(diǎn)[1]，2型糖尿病(T2DM)是其主要的危險(xiǎn)因素之一。研究表明，T2DM患者比非T2DM患者發(fā)生缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)高出2倍，同時(shí)合并有T2DM的缺血性腦卒中患者其神經(jīng)血管損傷也更廣泛，預(yù)后更差，再發(fā)腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)更高[2]。因此，研究T2DM伴發(fā)缺血性腦卒中的治療措施顯得尤為重要。近年來(lái)隨著干細(xì)胞研究和應(yīng)用的不斷深入，細(xì)胞治療逐漸成為了缺血性疾病的治療方法。1997 年得以發(fā)現(xiàn)并逐漸闡明的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)是定居于骨髓中，當(dāng)缺血缺氧、炎性介質(zhì)釋放等刺激后從骨髓中向外周循環(huán)血液中遷移，定向歸巢到缺血部位進(jìn)行增殖分化,參與生理性和病理性血管形成的骨髓干細(xì)胞[3]，它在促神經(jīng)血管修復(fù)和改善神經(jīng)功能缺損方面發(fā)揮了重要作用[4]。但T2DM患者循環(huán)血中EPCs含量降低，其遷徙增殖活性和血管代償性增生的能力下降，其下降程度與缺血性疾病的不良預(yù)后呈正相關(guān)[5]。脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)一種主要是由脂肪組織合成和分泌的蛋白質(zhì)，因其在改善胰島素抵抗、抗糖尿病等方面發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)而備受關(guān)注[6]。APN除了代謝相關(guān)功能，它還具有抗炎作用從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[7]，同時(shí)APN還具有參與調(diào)控EPCs遷移、增殖、分化功能的作用[8]。我們先前的研究表明APN基因修飾的EPCs可能是治療非T2DM大鼠腦缺血再灌注損傷(I/R)的一種有效的方法[9]。本研究將建立T2DM伴I/R損傷大鼠模型，給予APN轉(zhuǎn)染的EPCs(LV-APN-EPCs)干預(yù)，觀察LV-APN-EPCs對(duì)T2DM伴腦I/R損傷大鼠的治療效果及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠(4周齡、體重90～100 g的大鼠10只；5周齡、體重150～160 g的大鼠70只)，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(鄂)2015-0018。

1.1.2 主要試劑和儀器 60 kcal%高脂飼料(D12492)購(gòu)于北京華阜康公司；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；血糖儀及配套血糖檢測(cè)試紙購(gòu)于美國(guó)Johnson & Johnson公司；EPC專用培養(yǎng)基EGM-2MV培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Lonza公司；帶有綠色熒光蛋白和大鼠APN基因的慢病毒載體和帶有綠色熒光蛋白空載基因的對(duì)照慢病毒均購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因公司；CD31抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的ELISA試劑盒均購(gòu)于南京建成公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立及細(xì)胞干預(yù) 將70只5周齡SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、對(duì)照組(PBS組)、LV-APN-EPCs治療組、LV-EPCs治療組和EPCs治療組，每組各14只；高脂飼料喂養(yǎng)大鼠2周，以35 mg/kg劑量腹腔注射STZ，繼續(xù)喂養(yǎng)2周后檢測(cè)空腹血糖，含量≥16.7 mmoL/L判定為T2DM大鼠造模成功；麻醉PBS組、LV-APN-EPCs組、LV-EPCs組和EPCs組大鼠，longa法[10]制備I/R模型，sham組除不插入線栓外，其余步驟相同。10只4周齡SD大鼠，梯度密度離心法獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞層，添加EGM-2MV培養(yǎng)基，于5% CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d更換1次培養(yǎng)基;細(xì)胞生長(zhǎng)至第7 d隨機(jī)分成3組：正常對(duì)照組(EPCs組)、攜帶APN基因的慢病毒轉(zhuǎn)染組(LV-APN-EPCs組)和空白慢病毒轉(zhuǎn)染組(LV-EPCs組)。EPCs組繼續(xù)換液培養(yǎng)，LV-APN-EPCs組和LV-EPCs組細(xì)胞消化獲取細(xì)胞懸液，按照轉(zhuǎn)染倍數(shù)=100分別按組加入攜帶有綠色熒光蛋白與大鼠APN基因的慢病毒載體和帶有綠色熒光蛋白空載基因的對(duì)照慢病毒，培養(yǎng)第14 d消化下各組細(xì)胞;T2DM大鼠I/R 1 h后經(jīng)尾靜脈分別給予LV-APN-EPCs組、LV-EPCs組和EPCs組每只大鼠1×106/ml LV-APN-EPCs、LV-EPCs和EPCs 1mL，在相同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)尾靜脈注射sham組、PBS組大鼠PBS溶液1 mL。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分 5組大鼠分別于I/R前和I/R后第1、7、14 d，參照改良大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neurological severity score，mNSS)[11]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分為0～18分，0分為無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，18分為神經(jīng)功能缺損最嚴(yán)重。

1.2.3 HE染色 5組大鼠I/R后第14 d行HE染色；10%水合氯醛麻醉大鼠，4%多聚甲醛經(jīng)心臟進(jìn)行全身灌注內(nèi)固定，斷頭取腦，從視交叉前緣始向后切3 mm厚冠狀位腦組織塊，石蠟包埋，連續(xù)切片，每片標(biāo)本厚度約10 μm；常規(guī)HE染色，普通光鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.4 CD31免疫熒光染色 5組大鼠I/R后第14 d，行CD31免疫熒光染色檢測(cè)缺血區(qū)血管密度;使用CD31抗體對(duì)腦切片進(jìn)行免疫熒光染色后免疫熒光顯微鏡下觀察腦缺血區(qū)周圍皮質(zhì)的新生血管情況，隨機(jī)取多個(gè)視野計(jì)算熒光密度。

1.2.5 缺血腦組織炎癥指標(biāo)水平檢測(cè) 5組大鼠I/R后第14 d，ELISA 法檢測(cè)缺血腦組織中腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和白介素-1β (IL-1β)水平；10%水合氯醛麻醉大鼠，生理鹽水經(jīng)心臟進(jìn)行全身灌注后斷頭取腦，取腦梗死周圍皮質(zhì)制成勻漿液，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作檢測(cè)炎癥指標(biāo)水平。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠T2DM模型評(píng)估 高脂飲食結(jié)合STZ誘導(dǎo)制備T2DM模型前后各組大鼠的空腹血糖水平見圖1，所有大鼠在誘導(dǎo)后血糖均≥16.7 mmol/L，各組大鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿等癥狀，判定為T2DM大鼠造模成功。

圖1 各組大鼠糖尿病造模前后血糖水平 與高脂+STZ誘導(dǎo)前比較,*P<0.05

2.2 神經(jīng)功能評(píng)分 T2DM大鼠I/R后第7 d，LV-APN-EPCs組大鼠的mNss評(píng)分低于LV-EPCs組、EPCs組和PBS組[(5.60±0.52)與(7.70±0.82)、(8.20±1.14)、(9.30±0.82)分，P<0.05]；I/R后第14 d，LV-APN-EPCs組大鼠的mNss評(píng)分低于LV-EPCs組、EPCs組和PBS組[(4.50±0.53)與(6.40±0.52)、(6.50±0.71)、(7.80±0.63)分，P<0.05](圖2)。

圖2 各組T2DM大鼠I/R前和I/R后第1、7、14 d神經(jīng)功能評(píng)分 與PBS 組比較,#P<0.05;與LV-EPCs組和 EPCs組比較,*P<0.05

2.3 各組大鼠腦組織HE染色比較 與LV-EPCs組、EPCs組和PBS組比較，LV-APN-EPCs組大鼠神經(jīng)元破壞明顯減輕，變性、壞死的神經(jīng)元減少，間質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞減輕，胞質(zhì)中空泡減少(圖3)。

2.4 腦組織缺血區(qū)血管密度的檢測(cè) 免疫熒光顯微鏡觀察顯示，LV-APN-EPCs組大鼠腦組織缺血區(qū)皮質(zhì)血管密度高于LV-EPCs組、EPCs組和PBS組[(209.00±9.25)與(125.00±11.29)、(138.40±9.15)、(80.20±16.22)，P<0.05](圖4)。

圖3 各組大鼠缺血側(cè)腦組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色 ×400倍) A為sham組;B為PBS組;C為L(zhǎng)V-APN-EPCs組;D為L(zhǎng)V-EPCs組;E為EPCs組

圖4 各組大鼠缺血側(cè)腦組織血管密度(CD31免疫熒光染色 ×400倍) A為sham組;B為PBS組;C為L(zhǎng)V-APN-EPCs組;D為L(zhǎng)V-EPCs組;E為EPCs組;與PBS 組比較,#P<0.05;與LV-EPCs組和 EPCs組比較,*P<0.05

2.5 缺血腦組織皮質(zhì)炎癥指標(biāo)水平的檢測(cè) ELISA顯示LV-APN-EPCs組大鼠腦組織缺血區(qū)皮質(zhì)TNF-α水平低于LV-EPCs組、EPCs組和PBS組[(236.87±8.10)與(309.78±12.32)、(325.44±16.64)、(385.24±15.33)pg/mL，P<0.05]；LV-APN-EPCs組大鼠腦組織缺血區(qū)皮質(zhì)IL-1β水平低于LV-EPCs組、EPCs組和PBS組[(107.05±12.22)與(125.29±4.22)、(120.68±12.59)、(142.59±8.50)pg/mL，P<0.05](圖5)。

圖5 ELISA法檢測(cè)各組大鼠腦組織TNF-α和IL-1β表達(dá)水平 與PBS組比較,#P<0.05;與LV-EPCs組和 EPCs組比較,*P<0.05

3 討 論

缺血性腦卒中對(duì)人類的健康和生命造成了較大的威脅，缺血性腦卒中的發(fā)生減少了腦血流，通過激發(fā)血管重塑后促進(jìn)血管新生而改善血液供應(yīng)[12]。然而，糖尿病導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損和功能失調(diào)性血管再生的發(fā)生，使缺血性腦卒中的預(yù)后更差，對(duì)人類的威脅也就更大，故研究治療合并糖尿病的缺血性腦卒中的方法具有重要意義。本研究采用高脂飲食結(jié)合低劑量的STZ誘導(dǎo)T2DM大鼠模型，使大鼠處于糖尿病狀態(tài)[13]，再采用線栓法制備I/R模型，栓塞大腦中動(dòng)脈2 h后退出栓線以實(shí)現(xiàn)缺血再灌注損傷，模擬臨床上糖尿病患者I/R過程。

目前，血管再生醫(yī)學(xué)十分令人注目。血管再生是體內(nèi)修復(fù)受損血管的一個(gè)重要過程，它包括兩個(gè)基本過程，也就是血管生成和血管新生。血管生成從已存在的血管以生芽方式長(zhǎng)出新毛細(xì)血管的過程，而血管新生是內(nèi)皮前體細(xì)胞(如EPC)分化成內(nèi)皮細(xì)胞，形成原始血管網(wǎng)的過程。EPCs源于骨髓細(xì)胞，當(dāng)受到缺血等刺激時(shí)循環(huán)到外周血中促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)和促進(jìn)血管再生。近年來(lái)研究表明，EPCs移植治療在各種缺血性疾病中發(fā)揮了積極的作用，它定向歸巢到腦缺血區(qū)域、增殖分化、參與血管再生，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。Fan 等[14]研究發(fā)現(xiàn)通過移植EPCs治療MCAO小鼠可以改善大鼠的神經(jīng)功能并減小腦梗死體積。Kong等[14]將骨髓源性的EPCs干預(yù) MCAO模型大鼠，證實(shí)EPCs通過促進(jìn)血管新生形成新的血管。本研究發(fā)現(xiàn)EPCs移植可以增加血管密度和改善神經(jīng)功能，發(fā)揮對(duì)缺血性腦卒中的保護(hù)作用，它可能的機(jī)制是低灌注的腦組織釋放炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致EPCs歸巢到腦缺血組織區(qū)域，遷移分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與血管修復(fù)和血管再生，從而恢復(fù)血流和改善神經(jīng)功能。然而，單獨(dú)移植EPCs，因僅有少量的EPCs存活并歸巢到腦缺血區(qū)域，治療效果不佳，同時(shí)糖尿病狀態(tài)進(jìn)一步減少了循環(huán)EPCs數(shù)量，T2DM大鼠的EPCs的歸巢、遷移、分化、成管等功能受損[15]，使EPCs很難充分發(fā)揮其作用。因此，保證EPCs的數(shù)量及功能是治療合并糖尿病的缺血性腦卒中的重要手段。

APN在調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗動(dòng)脈粥樣硬化形成、抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮等方面發(fā)揮較大生物學(xué)作用[16]。Nakamura等[7]發(fā)現(xiàn)APN通過PI 3-kinase/Cdc42/Rac1通路促進(jìn) EPCs遷移。Huang等[17]研究證實(shí)APN通過增加內(nèi)皮型NO合酶的表達(dá)而減輕高糖狀態(tài)下EPCs功能受損。TNF-α和IL-1β是重要的神經(jīng)炎癥因子，Chen等研究表明APN通過下調(diào)TNF-α和IL-1β水平來(lái)發(fā)揮抗炎作用，有效地改善糖尿病患者的EPCs生物學(xué)功能，從而提高EPC治療性血管新生的作用[18]。故本研究將攜帶有APN基因的慢病毒轉(zhuǎn)染到EPCs，干預(yù)T2DM腦I/R損傷大鼠，研究LV-APN-EPCs對(duì)I/R的T2DM大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，將對(duì)合并有T2DM的缺血性腦血管病的治療提供新的思路。

改良大鼠神經(jīng)功能缺損(mNSS)評(píng)分用于評(píng)估大鼠的神經(jīng)功能，本研究結(jié)果表明LV-APN-EPCs治療較LV-EPCs組、EPCs組和PBS組明顯改善了T2DM大鼠I/R損傷的神經(jīng)功能缺損。通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，LV-APN-EPCs干預(yù)后T2DM大鼠神經(jīng)元的損傷程度減輕。另外，CD31免疫熒光染色顯示LV-APN-EPCs干預(yù)后T2DM大鼠腦組織缺血區(qū)血管密度均較其他干預(yù)組增加，ELISA檢測(cè)顯示腦缺血周圍皮質(zhì)的TNF-α水平和IL-1β水平較其他干預(yù)組降低，表明LV-APN-EPCs改善T2DM大鼠神經(jīng)功能損害可能是通過促進(jìn)缺血區(qū)血管新生，增加缺血區(qū)血液供應(yīng)和抗炎作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實(shí)LV-APN-EPCs對(duì)T2DM大鼠腦I/R損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其可能的機(jī)制是促進(jìn)缺血區(qū)血管的修復(fù)、再生和抑制炎癥因子表達(dá)。