蔡麗 張智博 毛新發(fā) 范衛(wèi)兵

腦缺血病灶半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞程序性死亡的主要形式為凋亡[1]。多種細(xì)胞因子及信號(hào)途徑參與腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的調(diào)控。胃酶抑素A(Pepstatin A)為組織蛋白酶D(cathepsin D，Cat D)的特異性抑制劑。在Amritraj等的研究中Pepstatin A可通過抑制Cat D的表達(dá)，減少細(xì)胞色素C及凋亡執(zhí)行蛋白酶胱天蛋白酶3(Caspase-3)的釋放，減少神經(jīng)元凋亡[2]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2，ERK1/2)為Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的最下游蛋白，其發(fā)生磷酸化激活后可由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等一系列活動(dòng)的調(diào)節(jié)[3]。在多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞的離體和在體模型中ERK1/2信號(hào)通路發(fā)生磷酸化活化后可抑制Caspase-3的表達(dá)，抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡[4-5]。Pepstatin A及p-ERK1/2均可調(diào)節(jié)腦缺血再灌注后半暗帶區(qū)神經(jīng)元的凋亡，但尚未有研究證實(shí)兩者之間是否相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用局灶性大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，檢測(cè)腦梗死體積、腦缺血2 h再灌注24 h后p-ERK1/2及Caspase-3的表達(dá)水平以及使用Pepstatin A干預(yù)后腦梗死體積、p-ERK1/2、Caspase-3表達(dá)水平的變化，旨在探討Pepstatin A保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

10～12周齡雄性健康Sprague-Dawley大鼠48只，體重(260±20)g，清潔級(jí)，由湖南省東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給，許可證號(hào)：SYXK(湘)2010-0013。飼養(yǎng)環(huán)境：濕度50%～60%，室溫22～24℃，敷料干潔，通風(fēng)良好，自由飲水?dāng)z食。依照隨機(jī)數(shù)字表法分配至假手術(shù)組(16只)、生理鹽水(對(duì)照)組(16只)及Pepstatin A干預(yù)組(16只)，假手術(shù)組、生理鹽水(對(duì)照)組、Pepstatin A干預(yù)組中隨機(jī)各取8只檢測(cè)腦梗死體積，余下8只行 western blot檢測(cè)p-ERK1/2及Caspase-3的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 動(dòng)物模型制作及行為學(xué)評(píng)價(jià)

參用改良的Longa線栓法制作大鼠右側(cè)MCAO再灌注模型。10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，頸前正中切口，顯露并分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，將頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎，夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈近心端，用眼科剪在頸總動(dòng)脈近分叉處剪一小口，插入栓線至其進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈約(18±0.5)mm遇輕微阻力時(shí)停止，2 h后拔出線栓形成再灌注。假手術(shù)組插入線栓長(zhǎng)度約10 mm。術(shù)中予照射燈保持大鼠肛溫在(37.0±0.5)℃，將術(shù)后大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，保持鼠籠溫暖干燥，并監(jiān)測(cè)呼吸、心率及體溫。

缺血2 h實(shí)現(xiàn)再灌注24 h時(shí)遵照Longa’s5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法評(píng)價(jià)首次神經(jīng)功能缺損評(píng)分。0分：行為學(xué)表現(xiàn)正常；1分：垂直提起大鼠時(shí)左側(cè)前爪屈曲在胸前，不能伸直；2分：行走時(shí)身體向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或者偏斜；3分：行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒；4分：有意識(shí)喪失，不能自主行走。納入造模成功評(píng)分為1～3分的大鼠，評(píng)分為0分或4分、提前死亡、處死時(shí)發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠棄之不用，并隨機(jī)補(bǔ)充。

1.3 胃酶抑素A干預(yù)

干預(yù)組于缺血再灌注即刻經(jīng)腹腔注射Pepstatin A配置液0.2 mL/10g(美國(guó)Sigma公司，粉劑，1 mg Pepstatin A經(jīng)1 mL二甲基亞砜溶解后再用生理鹽水稀釋至100 mL，最終濃度為0.01 mg/mL)，對(duì)照組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)經(jīng)腹腔注射等體積生理鹽水。

1.4 腦梗死體積測(cè)定

各組大鼠在缺血2 h再灌注24 h完成評(píng)分后迅速斷頭取腦，置于-20 ℃冰箱中冷凍20 min，按2.0 mm厚度行視交叉后冠狀位連續(xù)切片，可得5～6片，避光浸泡于1%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)磷酸鹽緩沖液中，于37 ℃恒溫箱孵育15 min；正常腦組織經(jīng)反應(yīng)后呈紅色，梗死腦組織則顏色蒼白。將處理后的腦組織置于4%多聚甲醛配置液中固定24 h后拍照，使用Image-pro plus7.0圖像分析軟件計(jì)算各層腦組織梗死區(qū)面積與總面積，按以下公式計(jì)算相對(duì)腦梗死體積：相對(duì)腦梗死體積=(Σ梗死面積/Σ全腦片面積)×100%。

1.5 Western blot檢測(cè)p-ERK1/2、Caspase-3的表達(dá)水平

取缺血側(cè)皮層組織約100 g(冠狀面距額極7～11 mm)，冰浴下充分勻漿，4 ℃離心(12000 r/min×10 min)，移取上清液至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，采用BCA法測(cè)定蛋白水平。取相應(yīng)組別等量目的蛋白制品，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再通過半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，放入封閉液(5%的脫脂奶粉)中封閉，在不同組別中分別加入一抗溶液p-ERK1/2抗體(1∶1000，Bioworld公司)、Caspase-3抗體(1∶1000，SantaCruz公司)，4 ℃過夜孵育，辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗鼠IgG二抗(1∶4000，SantaCruz公司)，室溫孵育2 h，暗室曝光，柯達(dá)洗片機(jī)洗片，膠片掃描，片上顯示目的蛋白條帶，用Quantity One圖像分析軟件計(jì)算相應(yīng)目標(biāo)條帶的光密度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶(beta-action 肌動(dòng)蛋白)光密度值的比值為檢測(cè)指標(biāo)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)評(píng)價(jià)

假手術(shù)組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分，干預(yù)組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(表1)。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積、p-ERK1/2、Caspase-3表達(dá)水平比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05(n1為行為學(xué)評(píng)分組樣本量，n2為其余組樣本量)

2.2 腦梗死體積

TTC染色顯示假手術(shù)組腦組織染色呈紅色，未見白色梗死灶；對(duì)照組及干預(yù)組均可見體積各異的白色梗死灶；2組相對(duì)腦梗死體積依次為(18.24±2.28)%和(15.44±1.40)%，其差異明顯(P<0.05)(表1，圖1)。

圖1 TTC染色 A為假手術(shù)組;B為生理鹽水(對(duì)照)組;C為干預(yù)組

2.3 腦缺血皮質(zhì)p-ERK1/2和Caspase-3的表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)顯示對(duì)照組中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；干預(yù)組中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)(表1，圖2)；干預(yù)組Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)水平則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(表1,圖3)。

圖2 Western blot檢測(cè)各組p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平

圖3 Western blot檢測(cè)各組Caspase-3的表達(dá)水平

3 討 論

缺血再灌注損傷神經(jīng)元凋亡的調(diào)控涉及多個(gè)細(xì)胞因子及信號(hào)途徑，形成1個(gè)交互作用的復(fù)雜體系[6]。體內(nèi)及體外研究結(jié)果表明，Pepstatin A與p-ERK1/2均涉及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。

Pepstatin A具有易合成、耐熱性好、性質(zhì)穩(wěn)定、毒性低等特點(diǎn)，可強(qiáng)有力地抑制Cat D[7]。現(xiàn)有研究表明，在神經(jīng)細(xì)胞、人類成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等中Pepstatin A具有抗細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[2, 8]。本研究Pepstatin A干預(yù)組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分、相對(duì)腦梗死體積以及Caspase-3的表達(dá)水平均顯著低于生理鹽水(對(duì)照)組。這提示Pepstatin A可改善大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)功能缺損，減少腦梗死體積及神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路主要通過ERK1/2的磷酸化來調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)歸，p-ERK1/2活化的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間為該信號(hào)途徑通向生存或死亡的關(guān)鍵[4, 9]。在多種腦缺血模型的實(shí)驗(yàn)中如大鼠MCAO、缺血預(yù)處理模型、缺血缺氧模型等p-ERK1/2的表達(dá)水平均顯著增加，其激活具有神經(jīng)保護(hù)作用[10-12]。本研究對(duì)照組p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平在缺血2 h再灌注24 h后較假手術(shù)組顯著增加，提示可能為缺血再灌注損傷中促凋亡因子釋放增多，p-ERK1/2的表達(dá)反應(yīng)性增加以對(duì)抗其腦損傷作用。

Pepstatin A抗凋亡神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制主要通過抑制Cat D蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。Cat D調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡主要通過以下三條路徑：第一，作用于經(jīng)典途徑如死亡受體途徑或線粒體途徑，而Bcl-2家族蛋白(Bax、Bid、Bcl-2等)為重要載體；第二，與炎癥細(xì)胞及炎癥因子相互關(guān)聯(lián)，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)；第三，激活凋亡相關(guān)信號(hào)途徑，抑制生存信號(hào)途徑[13-15]。而Yoshida等的研究結(jié)果表明，Pepstatin A可抑制受體活化素配體誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的增殖分化，該效應(yīng)是通過阻止ERK1/2信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，提示Pepstatin A可通過ERK1/2信號(hào)通路發(fā)揮其生理作用[16]。P-ERK1/2經(jīng)線粒體途徑及死亡受體途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡則主要是通過與Bcl-2家族蛋白(主要為Bid、Bcl-2等)的相互作用[17-18]。本研究使用Pepstatin A干預(yù)后p-ERK1/2的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高，干預(yù)組Caspase-3蛋白的表達(dá)較對(duì)照組減少，提示Pepstatin A可能通過上調(diào)p-ERK1/2的表達(dá)來保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷，抗細(xì)胞凋亡，Bcl-2家族蛋白可能為他們之間相互作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

綜上所述，Pepstatin A可能通過上調(diào)p-ERK1/2的表達(dá)，減少腦梗死體積及細(xì)胞凋亡發(fā)生，從而保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷。本研究仍存在一些缺陷，即第一，p-ERK1/2表達(dá)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)有限，無(wú)法動(dòng)態(tài)完整體現(xiàn)其趨勢(shì)變化；第二，未行Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)，定量體現(xiàn)Pepstatin A的抗凋亡作用；第三，Pepstatin A上調(diào)p-ERK1/2信號(hào)通路具體的作用靶點(diǎn)仍不明確，尚需進(jìn)一步研究。應(yīng)開拓思維，使腦缺血再灌注損傷的機(jī)制體系逐漸完善，給缺血性腦血管病的治療提供新的途徑。