張 嶠， 郝少歡， 吳 梅， 帕提古麗·阿爾西丁

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肺癌一病區(qū)， 烏魯木齊 830011； 2新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院腫瘤科， 新疆 喀什 844000)

腫瘤抗血管治療是目前肺癌治療的熱點(diǎn)之一，血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)是覆蓋于血管內(nèi)表面的單層扁平上皮細(xì)胞，與其下層的結(jié)締組織共同構(gòu)成血管內(nèi)膜層，具有接受、傳遞信息和分泌血管活性物質(zhì)等功能[1-2]。在腫瘤微環(huán)境作用下，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞在基因表達(dá)、生物學(xué)行為上具有明顯差異[3]。因此體外構(gòu)建人非小細(xì)胞肺癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human non-small lung cancer-microvascular endothelial cells，HNSCLC-MECs)模型，對(duì)深入研究腫瘤微環(huán)境下肺癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為，基因表達(dá)調(diào)控等均具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過篩網(wǎng)法、組織塊貼服法、胰酶消化法等方法組合對(duì)原代HNSCLC-MECs進(jìn)行分離、培養(yǎng)、純化并鑒定，為后續(xù)體外研究HNSCLC-MECs在肺癌血管發(fā)生中的作用提供細(xì)胞平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1取材收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2017年3月-2017年6月胸外科非小細(xì)胞肺癌手術(shù)組織標(biāo)本。

1.2主要試劑及儀器M199內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)，IV膠原酶、胰蛋白酶(Sigma公司)，F(xiàn)actor Ⅷ抗體(Abcam公司)，CD34 抗體與二抗、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG-HRP 抗體，兔抗人GAPDH多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，倒置顯微鏡(Olympus )等。

1.3主要試劑配制完全培養(yǎng)液：含醫(yī)用肝素100 U/mL，終濃度為10×104U/L青霉素/鏈霉素于含20%胎牛血清M199培養(yǎng)基。

1.4標(biāo)本的保存人非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本經(jīng)無(wú)菌取材后置于4℃、M199培養(yǎng)液低溫條件下30 min內(nèi)送至細(xì)胞培養(yǎng)室。

1.5人非小細(xì)胞肺癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)無(wú)菌條件下組織標(biāo)本經(jīng)預(yù)冷PBS 液反復(fù)沖洗至無(wú)血液殘留，玻璃勻漿器研磨后無(wú)菌200 目鋼篩網(wǎng)過濾收集沉淀。0.25%胰蛋白酶常溫消化90 min，200 目鋼篩網(wǎng)再次過濾收集沉淀。0.5%膠原酶常溫消化90 min，無(wú)菌500目鋼篩網(wǎng)過濾后收集血管薄膜樣組織塊。將組織塊置入含M199完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，保持組織塊與培養(yǎng)皿底部接觸，培養(yǎng)基剛沒過組織塊。37℃、5% CO2培養(yǎng)60 h，移出組織塊，選擇周圍細(xì)胞貼壁且血細(xì)胞較少的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d。每2～3天更換培養(yǎng)液，共培養(yǎng)7～10 d，倒置顯微鏡觀察HNSCLC-MECs的生長(zhǎng)情況。

1.6HNSCLC-MECs的純化及傳代顯微鏡下標(biāo)記纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域， 0.25%胰蛋白酶消化30 s～1 min，觀察細(xì)胞形態(tài)及脫壁，加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打標(biāo)記部位，M199培養(yǎng)基漂洗后加入適量完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度>80%時(shí)可進(jìn)行傳代，應(yīng)用0.25%胰蛋白酶常溫消化2～3 min，待細(xì)胞變圓、貼壁運(yùn)動(dòng)時(shí)加5～8 mL完全培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞層，1 200 r/min離心3 min，收集細(xì)胞混懸液置新的培養(yǎng)皿中，加入適量完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吹打混勻。

1.7人非小細(xì)胞肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定

1.7.1 形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)。

1.7.2 細(xì)胞表面標(biāo)志物免疫組織化學(xué)染色 將HNSCLC-MECs接種至蓋玻片上，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS清洗 3次，每次5 min。加入Factor Ⅷ抗體與CD34 抗體(稀釋比例1∶200)， 4℃孵育過夜。PBS清洗3次，加入羊抗兔IgG-HRP 抗體，兔抗人GAPDH多克隆抗體(稀釋比例1∶500)，37℃避光孵育1 h。PBS清洗3次，5 μg/mL的DAPI細(xì)胞核染色5 min，PBS清洗3次后終止顯色，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.8主要觀察指標(biāo)人非小細(xì)胞肺癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Factor Ⅷ和CD34免疫組織化學(xué)染色。

2 結(jié)果

2.1倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞HNSCLC-MECs原代培養(yǎng)24～48 h后可見極少量細(xì)胞從組織塊中爬出，形態(tài)不一，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)。約60 h后可見少量貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后貼壁細(xì)胞數(shù)量較前增加，細(xì)胞呈三角形，多邊形、短梭型，形態(tài)不一。培養(yǎng)7～10 d后貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，部分細(xì)胞可見圓形細(xì)胞核，胞質(zhì)較前飽滿，細(xì)胞呈三角形，梭型，棍狀。傳代培養(yǎng)后細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快，傳代9～10 d后細(xì)胞數(shù)量>80%，細(xì)胞呈短梭型，胞體大，折光性強(qiáng)，單層細(xì)胞呈典型“鋪路石”樣改變，可見接觸抑制現(xiàn)象，見圖1。

2.2人非小細(xì)胞肺癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定結(jié)果選擇2～5代的HNSCLC-MECs，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察HNSCLC-MECs內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗體Factor Ⅷ及CD34免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，可見Factor Ⅷ及CD34抗體表達(dá)于細(xì)胞膜，CD34呈紅色熒光，F(xiàn)actor Ⅷ呈綠色熒光；DAPI表達(dá)于細(xì)胞核，呈藍(lán)色熒光，表達(dá)陽(yáng)性率>95%，見圖2。

細(xì)胞培養(yǎng)3 d

細(xì)胞培養(yǎng)5 d

細(xì)胞培養(yǎng)7 d

細(xì)胞培養(yǎng)10 d

細(xì)胞傳代后10 d

圖1體外培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)

DAPI

CD34

CD34

CD34和DAPI混合染色

Factor Ⅷ

DAPI Factor Ⅷ Factor Ⅷ和DAPI混合染色

圖2激光共聚焦顯微鏡下觀察人非小細(xì)胞肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮抗體FactorⅧ及CD34的表達(dá)(×400)

3 討論

腫瘤新生血管網(wǎng)是腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成腫瘤新生血管的主要成分，具有分泌血管活性物質(zhì)，參與炎癥、免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞粘附等作用[4-7]。在腫瘤相關(guān)微環(huán)境作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出異常的增殖、遷移等生物學(xué)行為，分泌特定的血管生成因子，參與新生血管的發(fā)生。因此培養(yǎng)獲得腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)研究腫瘤血管發(fā)生具有重要意義。

常用的血管內(nèi)皮細(xì)胞分離方法有免疫磁珠分選法[8]、酶組織消化法[9]、梯度離心法[10-11]、組織塊貼壁法[12-13]等。免疫磁珠分選法是利用細(xì)胞表面抗原與帶有特異性抗體的磁珠發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，從而在外磁場(chǎng)中分離細(xì)胞。該方法獲得內(nèi)皮細(xì)胞較為純凈，但細(xì)胞損傷大。酶組織消化法指根據(jù)不同酶消化速率的不同而組合消化分離細(xì)胞的方法。該方法對(duì)細(xì)胞消化時(shí)間要求準(zhǔn)確，易污染，多次傳代后細(xì)胞脫落死亡比例高。梯度離心法是在PercoⅡ密度梯度分選法基礎(chǔ)上根據(jù)不同細(xì)胞沉降系數(shù)差異經(jīng)多個(gè)PercoⅡ密度梯度獲得內(nèi)皮細(xì)胞。組織塊貼壁法是利用內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的特點(diǎn)，將小的組織塊平鋪在培養(yǎng)皿底部，從組織邊緣爬出的細(xì)胞為原代細(xì)胞。該方法應(yīng)用廣泛，操作方法簡(jiǎn)便易行，多與其他方法聯(lián)用。

本實(shí)驗(yàn)為尋找簡(jiǎn)便易行的人非小細(xì)胞肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，選擇篩網(wǎng)法、組織塊貼服法與酶組織消化法相結(jié)合獲得原代細(xì)胞，經(jīng)2～3次傳代后可獲得純度>80%的人非小細(xì)胞肺癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞。在原代培養(yǎng)的過程中我們發(fā)現(xiàn)：血細(xì)胞通常在24 h內(nèi)從組織塊游出，內(nèi)皮細(xì)胞在48 h后逐漸從組織塊中爬出，成纖維細(xì)胞約為72 h。傳統(tǒng)的做法是將肺組織剪碎至1 mm3的小塊，貼于鋪有1%明膠的培養(yǎng)瓶底部，60 h后移出組織塊，通過換液及傳代去除漂浮的血細(xì)胞。但實(shí)際情況是部分纖維細(xì)胞會(huì)在60 h內(nèi)爬出組織塊，因成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)速度快于HNSCLC-MECs，5～7 d后成纖維細(xì)胞會(huì)覆蓋HNSCLC-MECs，且細(xì)胞爬出數(shù)量少，培養(yǎng)周期長(zhǎng)。因此本研究將組織塊經(jīng)玻璃勻漿器研磨至近糊狀，經(jīng)篩網(wǎng)過濾后選擇薄膜樣組織貼于培養(yǎng)瓶底部，培養(yǎng)基加至組織塊剛好與培養(yǎng)皿接觸。這樣細(xì)胞爬出速度及數(shù)量明顯增多，但更為細(xì)小的組織塊更易干燥卷曲。其次本研究對(duì)比了組織塊直接貼服培養(yǎng)與經(jīng)0.25%胰蛋白酶、0.5%膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)原代細(xì)胞爬出速度，比較可見經(jīng)酶消化后內(nèi)皮細(xì)胞爬出速度加快，數(shù)量增多。內(nèi)皮細(xì)胞的純化是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重點(diǎn)，結(jié)合成纖維細(xì)胞較內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)胰酶更敏感，脫壁速度快的特點(diǎn)，采用了短時(shí)局部消化法和差速粘附法進(jìn)行純化。操作過程中應(yīng)注意手法輕柔及無(wú)菌操作。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)HNSCLC-MECs原代細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，并沒有典型的“鋪路石”樣改變，但傳代后生長(zhǎng)速度明顯加快，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致。

目前微血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定最常用的標(biāo)志物為CD31、CD34、F8RA/Vwf、Tie2，研究顯示目前沒有一種標(biāo)志物可以完全顯示不同時(shí)期的腫瘤微血管或單一的內(nèi)皮細(xì)胞。相較于CD31和F8RA/Vwf，CD34對(duì)較早期的不成熟微血管或內(nèi)皮細(xì)胞更為敏感[5,7,14]，F(xiàn)8RA/Vwf是最早發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物[15-16]，廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，肝、脾血竇內(nèi)皮組織，淋巴管內(nèi)皮及血小板表面。因此本實(shí)驗(yàn)選擇CD34及Factor Ⅷ 互相驗(yàn)證共同鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞是否為血管內(nèi)皮細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察可見CD34及Factor Ⅷ均表達(dá)于細(xì)胞表面，成綠色熒光。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上多次實(shí)踐，應(yīng)用組織塊貼壁法、篩網(wǎng)法配合胰酶的短時(shí)少量應(yīng)用，成功獲得人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過細(xì)胞形態(tài)及標(biāo)志物鑒定符合血管內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，為體外研究肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性及相關(guān)分子機(jī)制提供了新的途徑。