陶周善 周皖舒 江云云 吳興凈 王林 楊民 謝加兵 徐祝軍

1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 2410002.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院老年病科，安徽 蕪湖 241000

骨組織的形成和重吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡受成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的調(diào)控，隨著年齡的增長，特別是對于絕經(jīng)后婦女，當(dāng)骨吸收率超過骨形成速率時(shí)，骨組織會(huì)被破壞，這可能會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[1]。隨著社會(huì)老年人群不斷增加，近年來骨質(zhì)疏松癥成為繼冠心病后危害人群健康的全球性問題[2]。這類患者一旦發(fā)生骨折或缺損，需要整形手術(shù)進(jìn)行骨修復(fù)，但是這類患者本身骨質(zhì)較差，大都年齡較大且合并較多的基礎(chǔ)疾病，自體骨移植很難滿足骨缺損修復(fù)的需要[3]。近年來隨著生物組織工程的不斷發(fā)展，一系列人工生物材料被應(yīng)用于臨床并取得較好的效果，其中以磷酸鈣材料使用最為廣泛，但是這類材料在骨質(zhì)疏松狀態(tài)下表現(xiàn)不佳[4]，主要由于骨質(zhì)疏松狀態(tài)下局部成骨能力顯著下降，嚴(yán)重影響材料的骨誘導(dǎo)作用的發(fā)揮[5]。近些年的研究表明局部添加鍶離子(Sr)或骨形成蛋白-2(BMP-2)可以顯著促進(jìn)骨材料的骨誘導(dǎo)能力，加速骨愈合[6,7]；同時(shí)骨材料中摻Sr可以促進(jìn)局部形成BMP-2來促進(jìn)骨誘導(dǎo)，增加材料骨的誘導(dǎo)能力[8]。鑒于此，是否可以通過外界添加BMP-2和Sr來共同促進(jìn)骨愈合。本研究通過局部添加BMP-2和Sr制成負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣復(fù)合材料，通過其對大鼠成骨細(xì)胞增殖和分化的影響來探索這種材料治療骨質(zhì)疏松骨缺損的細(xì)胞學(xué)可行性。

1 材料和方法

1.1 試劑與材料

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo公司)；骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)、核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-KB, RANK)和核因子κB受體活化因子配體(ligand of receptor activator of nuclear factor-κB, RANKL)多克隆抗體(SantaCruz公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus 公司)；碘佛醇(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(BioTek 公司)；磷酸四鈣，無水磷酸氫鈣和無水磷酸氫鍶(上海熹垣生物科技有限公司)；胎牛血清(Sciencell 公司)；磷酸鈣干粉(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；α-MEM 培養(yǎng)基(維森特公司)；CCK-8 試劑(日本同仁化學(xué)研究所)；磷酸(深圳市思美泉生物科技有限公司)；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(購于碧云天公司)；茜素紅S染色液(索萊寶公司)；成骨細(xì)胞(SD 大鼠胎鼠顱骨分離所得)。

1.2 材料制備

負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣復(fù)合材料制備：摻鍶磷酸鈣固相成分通過磷酸四鈣，無水磷酸氫鈣和無水磷酸氫鍶按照1∶0.75∶0.25質(zhì)量比例充分混合而成，固化劑為0.5 mol/L稀磷酸，在室溫、100%相對濕度條件下分別固化 24 h，制成直徑1 mm，厚1 mm 樣品(固化時(shí)粉、液質(zhì)量比為2∶1)；將上述制作完成的5%摻鍶磷酸鈣，按每1 g 5%摻鍶磷酸鈣攜載 0.4 mg的比例稱取BMP-2材料 0.4 mg，加入 0.6 mL碘佛醇注射液中，震蕩混勻直至溶解，同時(shí)加入1 g 新制備的5%摻鍶磷酸鈣，4 ℃ 固化保存?zhèn)溆?。磷酸鈣干粉和0.5 mol/L稀磷酸按照固化時(shí)粉、液質(zhì)量2∶1制備單純磷酸鈣材料。

1.3 成骨細(xì)胞的培養(yǎng)

本研究分為3組：即空白對照組(Con組)、磷酸鈣組(CPC組)和復(fù)合材料組(BSCPC 組);將第四代大鼠成骨細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種到96 孔板中，CPC 組和BSCPC 組的培養(yǎng)液中分別加入磷酸鈣和負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣，37 ℃, 5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)，隔日換液。

1.4 材料共培養(yǎng)對成骨細(xì)胞的影響

1.4.1細(xì)胞增殖情況：將成骨細(xì)胞以2×105接種于96孔板(37 ℃，100%相對濕度，5%CO2)中。CPC 組和BSCPC組在每個(gè)孔中分別加入磷酸鈣和負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣以在24 h后代替培養(yǎng)基。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8 試劑盒在第1、3、5和7 d測定細(xì)胞增殖。 通過分光光度計(jì)在450 nm處檢測上清液的光密度(OD)。

1.4.2成骨細(xì)胞ALP活性染色：將成骨細(xì)胞以2×105接種于24孔板，CPC 組和BSCPC組在每個(gè)孔中分別加入磷酸鈣和負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣，用細(xì)胞分化液共培養(yǎng)14 d。使用ALP酶活性染色試劑盒測定ALP活性，其通過底物的藍(lán)色指示ALP活性。 在光學(xué)顯微鏡下獲得圖像。

1.4.3成骨細(xì)胞茜素紅染色：將成骨細(xì)胞以1×105接種于24孔板，CPC 組和BSCPC組在每個(gè)孔中分別加入磷酸鈣和負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣，并與其一起共培養(yǎng)21 d。使用茜素紅試劑盒染色檢測細(xì)胞礦化能力，其通過改變底物的顏色來指示細(xì)胞礦化紅色。在光學(xué)顯微鏡下獲得圖像。

1.4.4OPG、RANK、RANKL蛋白表達(dá)情況：按上述方案培養(yǎng)到14 d，提取細(xì)胞總蛋白，加熱變性后，于-20 ℃保存。取蛋白30 μL，進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，用封閉液封閉濾膜 4 h，依次結(jié)合相應(yīng)濃度的抗OPG、RANK及RANKL和抗β-actin抗體(1∶1 000)，于4 ℃孵育過夜，洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/兔抗鼠(1∶2 000)，孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光法曝光膠片，沖洗顯色，檢測相應(yīng)蛋白條帶。用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 共培養(yǎng)對成骨細(xì)胞增殖影響

經(jīng)過不同材料共培養(yǎng)1、3、5和7 d，CCK-8檢測的結(jié)果如圖1所示，相對于Con組，CPC 組和BSCPC組的成骨細(xì)胞數(shù)目明顯增加，和對照組比較相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且以BSCPC組成骨細(xì)胞數(shù)目最多(P<0.05)，這表明負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣對成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)作用顯著。

圖1 成骨細(xì)胞增殖情況注：與Con組比較，*P<0.05；與CPC 組比較，#P<0.05Fig.1 The proliferation of osteoblasts

2.2 成骨細(xì)胞茜素紅染色及堿性磷酸酶活性

經(jīng)過不同材料共培養(yǎng)14 d及21 d，各組堿性磷酸酶染色及細(xì)胞茜素紅染色的結(jié)果如圖2 A、B所示，定量結(jié)果如圖2 C、D所示，結(jié)果表明CPC 組和BSCPC組的成骨細(xì)胞的礦化能力及ALP活性明顯增加，和對照組比較相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且以BSCPC組細(xì)胞鈣化能力最強(qiáng)及ALP活性最高(P<0.05)，這表明負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣可以顯著提高成骨細(xì)胞礦化能力及ALP活性。

2.3 成骨細(xì)胞OPG、RANK及RANKL表達(dá)情況

經(jīng)過不同材料共培養(yǎng)7 d，各組細(xì)胞OPG、RANK及RANKL蛋白表達(dá)的結(jié)果如圖3 A所示，定量結(jié)果如圖3 B所示，結(jié)果表明CPC 組和BSCPC組的成骨細(xì)胞的OPG表達(dá)明顯增加，而RANK及RANKL蛋白表達(dá)明顯降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且以BSCPC組的成骨細(xì)胞蛋白OPG、RANK及RANKL蛋白表達(dá)量改善最為顯著(P<0.05)，這表明負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣對成骨細(xì)胞OPG、RANK及RANKL蛋白表達(dá)影響顯著。

圖3 各組細(xì)胞OPG、RANK及RANKL蛋白表達(dá)情況注：A 各組細(xì)胞OPG、RANK及RANKL蛋白表達(dá)的結(jié)果；B 定量結(jié)果(與Con組比較，*P<0.05；與CPC 組比較，#P<0.05)Fig.3 The protein expressions of OPG, RANK, and RANKL in each group

3 討論

修復(fù)由創(chuàng)傷、腫瘤、感染等原因引起的骨缺損仍然是骨科醫(yī)生面臨的主要挑戰(zhàn)之一。盡管自體骨多年來一直被認(rèn)為是骨移植材料的金標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)槠鋬?yōu)異的成骨組合(含有活的祖細(xì)胞)、骨誘導(dǎo)(含有許多能夠募集祖細(xì)胞和/或異位骨形成的生長因子)和骨傳導(dǎo)(能夠支持三維組織向內(nèi)生長和未來的新骨形成)[9]。由于供應(yīng)有限，供體部位的并發(fā)癥以及疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，自體移植和同種異體移植在臨床中應(yīng)用受到限制[10]。近年來隨著骨生物材料制造技術(shù)不斷發(fā)展，組織工程骨在骨缺損修復(fù)巨大潛力越來越受到人們的重視[11]。迄今為止，合成的骨移植替代品中磷酸鈣類的生物材料是最有希望的，由于其與骨礦物狀態(tài)下的化學(xué)結(jié)果相似[12]。盡管如此，合成骨移植物的性能仍然不如自體移植物，由于缺少必要的骨誘導(dǎo)性能。

近年來主要通過這幾種方案來提高磷酸鈣材料修復(fù)骨缺損的能力，包括將它們與促骨形成因子，細(xì)胞和無機(jī)添加劑結(jié)合來加強(qiáng)其修復(fù)效果[13]。將鎂(Mg)，鍶(Sr)等無機(jī)添加劑摻入合成骨移植物中越來越受歡迎，因?yàn)檫@些添加劑可能直接誘導(dǎo)細(xì)胞的變化，例如通過離子通道，潛在地起到“合成生長因子”的作用[13]。這些生物無機(jī)物在骨組織中的潛在作用以及它們對骨形成的作用，在我們早期發(fā)表的文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)[6]。在骨組織工程中已經(jīng)進(jìn)行了大量的努力以將成骨生長因子與支架結(jié)合以控制它們的釋放，從而以最小的副作用再生骨缺損[14]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化和器官發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用[15]。據(jù)報(bào)道，在通過縮短手術(shù)時(shí)間和降低住院費(fèi)用方面，使用BMP-2比“金標(biāo)準(zhǔn)”自體骨移植更有優(yōu)勢，然而BMP-2使用也帶來了一部分副作用，這些副作用歸因于局部高劑量BMP-2不受控制的釋放；同時(shí)一些研究顯示了BMP-2的使用與癌發(fā)生之間的聯(lián)系[16]。

本研究中通過組織工程手段合成負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣復(fù)合材料，我們BMP-2劑量較低，同時(shí)由于材料組添加了Sr，即可通過刺激局部合成骨形成相關(guān)因子彌補(bǔ)BMP-2劑量不足對骨形成誘導(dǎo)能力降低的影響，有潛力在降低BMP-2劑量的同時(shí)不降低骨誘導(dǎo)效果。我們的研究結(jié)果顯示BSCPC組的成骨細(xì)胞增殖情況顯著優(yōu)于Con組和CPC組；同時(shí)BSCPC組ALP染色和茜素紅染色結(jié)果顯示該組成骨細(xì)胞的活性更高，且礦化能力更強(qiáng)；BSCPC組成骨細(xì)胞OPG、RANK及RANKL蛋白表達(dá)的結(jié)果更好的表明負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣復(fù)合材料能改善成骨細(xì)胞成骨能力。我們認(rèn)為負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣復(fù)合材料較單獨(dú)復(fù)合BMP-2或添加Sr具有較大的優(yōu)勢，既可以避免局部大劑量BMP-2爆發(fā)性釋放出現(xiàn)的不良反應(yīng)[16]；同時(shí)由于Sr這類無機(jī)材料通過改善成骨因子來促進(jìn)成骨[17]，不同于BMP-2直接作用成骨細(xì)胞，對后續(xù)的骨形成促進(jìn)作用意義重大。

總的來說，我們研究證實(shí)了負(fù)載BMP-2摻鍶磷酸鈣復(fù)合材料對成骨細(xì)胞增殖分化和改善細(xì)胞活性和功能方面的作用顯著；本研究也有不足之處，分組較少，且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尚未進(jìn)行；且這種材料和較高劑量的單獨(dú)摻BMP-2磷酸鈣復(fù)合材料或較高劑量的單獨(dú)摻鍶磷酸鈣復(fù)合材料成骨效果尚未進(jìn)行比較，因此后期進(jìn)一步研究這種復(fù)合材料的優(yōu)勢顯得非常有必要。