劉雅蓉, 吳鴻飛，戴 敏

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2. 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 安徽 合肥 230038；3. 安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)的炎性損傷和功能障礙是AS形成的始動環(huán)節(jié)[1]。細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為微生物感染的主要致病因素能夠刺激內(nèi)皮損傷，是公認(rèn)的致內(nèi)皮損傷的危險因子之一[2]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是構(gòu)成血管壁另一重要組成成分，其凋亡參與AS及再狹窄的發(fā)生發(fā)展[3]。p38 MAPK信號通路在調(diào)控細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要的作用[4]，其下游蛋白中p53和caspase-3與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系[5]。本課題組已有研究表明LPS可以誘導(dǎo)與VSMCs共培養(yǎng)的VECs黏附功能改變[6]，但是LPS對VECs的炎癥損傷是否會影響VSMCs的正常功能及其機(jī)制尚不知曉。

丹皮酚(Paeonol，Pae)是從毛茛科植物牡丹PaeoniaSuffruticoasAndr.的干燥根皮及蘿摩科植物徐長卿Cynanchumpaniculatum(Bge.)Kitag.的干燥根及根莖中提取出來的有效成分之一。前期的研究已證實(shí)Pae可以抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VECs中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)釋放，減少VECs的炎性反應(yīng)[7-8]，并且可以明顯降低由LPS誘導(dǎo)的PI3K/AKT-NF-κB通路[9]，發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮損傷的作用。而Pae對VECs炎性反應(yīng)的抑制作用是否會影響VSMCs凋亡還需進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)以VSMCs凋亡為切入點(diǎn)，闡明Pae抗AS作用的分子機(jī)制，為研究Pae治療AS提供新的靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，清潔級，體質(zhì)量(160±10)g，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2016-0015]提供。

1.2 主要藥物與試劑 Pae：宣城百草植物工貿(mào)有限公司，純度99%；LPS：美國Sigma公司；Transwell小室：美國Gibco公司，孔徑：0.4 μm；Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒：上海貝博生物試劑；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)ELISA試劑盒：美國Biosource公司；鼠抗β-actin抗體(批號 AP0065)、兔抗MKK3/6抗體(批號 BS1784)、兔抗P-MKK3/6抗體(批號 BS1225)、兔抗p38抗體(批號 BS6412)、兔抗P-p38抗體(批號 BS1689)、兔抗p53抗體(批號 BS3746)、兔抗caspase-3抗體(批號 BS3723)：Bioworld Technology公司。

1.3 主要儀器 MCO-175型CO2培養(yǎng)箱：日本Sanyo公司；SW-CJ-1F型潔凈工作臺：蘇凈集團(tuán)安泰公司；CK2型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；ELX800uv酶標(biāo)儀：Bio-TEK公司；Hoefer電泳儀：Amersham Biosciences公司。

2 方法

2.1 大鼠胸主動脈VECs及VSMCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 參照文獻(xiàn)[10-13]的方法進(jìn)行操作。取大鼠胸主動脈，將血管外翻，暴露內(nèi)膜，血管兩端扎緊，0.25% Ⅰ型膠原酶消化1 h，切成2 mm×2 mm的小塊，保持血管內(nèi)膜朝下，貼在鼠尾膠原包被過的細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取大鼠胸主動脈血管，同樣操作使血管內(nèi)膜暴露出來，用刀片小心地自上而下刮1～2遍，以去除血管內(nèi)皮細(xì)胞，露出中膜層，0.3% Ⅰ型膠原酶消化1 h，切成2 mm×2 mm小塊，保持中膜層朝下，貼在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)到約80%的時候，即可進(jìn)行細(xì)胞傳代，在原代細(xì)胞第一次傳代時，采用差速消化、差速貼壁法純化細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)所采用的細(xì)胞均是3～5代細(xì)胞。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定VECs胞漿內(nèi)Ⅷ因子相關(guān)抗原以及VSMCs胞漿內(nèi)α-SMA的表達(dá)，確定分離出的細(xì)胞確實(shí)為VECs以及VSMCs。

2.2 VECs和VSMCs共培養(yǎng)模型的復(fù)制 借助Transwell小室建立共培養(yǎng)體系，無菌條件下，將VECs(1×105/mL)接種于6孔板底部，另取空白孔放上Transwell小室，將VSMCs(1×105/mL)接種在Transwell小室中，待兩種細(xì)胞均貼壁生長后，吸棄原培養(yǎng)基，將Transwell小室移到種有VECs的孔中，重新加入DMEM(含15% FBS)，建立起共培養(yǎng)體系，兩種細(xì)胞間不發(fā)生直接細(xì)胞連接，VECs主要是通過分泌因子透過Transwell膜影響VSMCs。

2.3 MTT檢測LPS損傷作用及Pae保護(hù)作用的量效時效關(guān)系 將VECs細(xì)胞混懸液(1×105/mL)接種于96孔板中培養(yǎng)，每孔加入含有不同濃度的LPS(1、10、100、1 000、10 000 ng/mL)培養(yǎng)液200 μL，另設(shè)不含LPS的培養(yǎng)液為正常對照組，分別于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時間(1、3、5、7、9 h)。每孔分別加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，小心吸棄上清細(xì)胞培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO溶解MTT，振蕩器混勻，酶標(biāo)儀490 nm測定吸光度(absorbance, A)值。細(xì)胞抑制率=(正常對照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/正常對照組A值×100%。

另取細(xì)胞，每孔預(yù)先給予含不同濃度(7.5、15、30、60、120 μmol/L)Pae的培養(yǎng)液200 μL，分別于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時間(6、12、24、36、48 h)。吸棄原培養(yǎng)液，PBS輕洗1次，每孔加入含LPS(100 ng/mL)的培養(yǎng)液200 μL繼續(xù)孵育7 h。另設(shè)單加培養(yǎng)液為正常對照組。同樣方式檢測A值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/正常對照組A值×100%。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 建立共培養(yǎng)體系，進(jìn)行分組干預(yù)。①正常對照組：用DMEM(含2% FBS)培養(yǎng)細(xì)胞；②LPS組：用含LPS(100 ng/mL)的培養(yǎng)液孵育7 h；③Pae(15、30、60 μmol/L)組：預(yù)先用含15、30、60 μmol/L Pae的培養(yǎng)液孵育24 h，吸棄培養(yǎng)液，再分別加入含LPS(100 ng/mL)的培養(yǎng)液孵育7 h；④TNF-α抑制劑組：先加入含10 μg/mL TNF-α抑制劑的培養(yǎng)液孵育24 h，吸棄培養(yǎng)液，再加入含LPS(100 ng/mL)的培養(yǎng)液孵育7 h；⑤SB203580組：先加入含20 μmol/L SB203580的培養(yǎng)液孵育2 h，吸棄培養(yǎng)液，再加入含LPS(100 ng/mL)的培養(yǎng)液孵育7 h。

2.5 ELISA法檢測TNF-α 吸取各組細(xì)胞上清液備用。將標(biāo)準(zhǔn)品按規(guī)定濃度依次稀釋；加樣：空白對照孔只加顯色劑和終止液，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品、50 μL鏈霉素-HRP，待測樣品孔加入各細(xì)胞上清液樣品40 μL、抗TNF-α抗體10 μL、鏈霉親和素-HRP 50 μL。每組樣品設(shè)置3個復(fù)孔，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育60 min。經(jīng)過洗滌、顯色及終止反應(yīng)后，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測量各孔的A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測VSMCs凋亡率 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，各組細(xì)胞加入500 μL不含EDTA的胰酶，于培養(yǎng)箱中消化50 s，1 800 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。加入預(yù)冷PBS重新混懸細(xì)胞，1 800 r/min離心5 min，棄去PBS，重復(fù)兩次。加入400 μL Annexin Ⅴ結(jié)合液混懸細(xì)胞(1×106/mL)，在細(xì)胞混懸液中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC染色液，輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育15 min，再加入10 μL PI染色液后輕輕混勻，于2～8 ℃避光條件下孵育5 min，立即用流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長為488 nm，F(xiàn)L1通道檢測Annexin Ⅴ-FITC的綠色熒光信號，PI紅色熒光在620 nm，通過FL3通道檢測。

2.7 Western blotting檢測蛋白變化 提取各組細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉常溫封閉4 h后，用PBST洗滌3遍，每次10 min。將硝酸纖維素膜放入一抗稀釋液稀釋的一抗中，4 ℃孵育過夜。用PBST洗3遍，每次10 min。加入脫脂奶粉稀釋的二抗IgG-HRP，室溫孵育2 h。用PBST洗3遍，每次10 min。用化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖片。

3 結(jié)果

3.1 LPS損傷VECs的量效時效關(guān)系 不同濃度的LPS作用不同時間，對VECs有不同程度的損傷。在濃度為100 ng/mL，刺激時間為7 h時，LPS對VECs的抑制率最大(P<0.05)，故選擇該濃度和作用時間作為最佳刺激濃度和時間。見圖1。

注：與正常對照組(LPS 0 ng/mL組)比較，*P<0.05

3.2 Pae對LPS損傷的VECs保護(hù)作用的量效、時效關(guān)系 LPS作用后，各組VECs存活率均有顯著降低(P<0.05)；不同濃度Pae作用不同時間，對LPS(100 ng/mL)誘導(dǎo)損傷的VECs均具有不同程度的保護(hù)作用。其中15、30、60 μmol/L Pae作用24 h對VECs損傷的保護(hù)作用最為明顯，設(shè)為Pae最佳作用濃度及最佳作用時間。見圖2。

3.3 Pae抑制LPS損傷的VECs分泌TNF-α 與正常對照組相比，LPS顯著提高VECs分泌的TNF-α水平(P<0.05)；給予15 μmol/L Pae預(yù)保護(hù)的細(xì)胞，與LPS刺激組相比，TNF-α水平顯著降低(P<0.05)；給予30、60 μmol/L Pae預(yù)保護(hù)的細(xì)胞，與LPS刺激組相比，TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)。見圖3。表明LPS可誘導(dǎo)VECs釋放TNF-α，而Pae可顯著抑制VECs中TNF-α的釋放。

注：與正常對照組[Pae(-)、LPS(-)組]比較，*P<0.05；與LPS組[Pae(-)、LPS(+)組]比較，#P<0.05

注：與正常對照組[Pae(-)、LPS(-)組]比較，*P<0.05；與LPS組[Pae(-)、LPS(+)組]比較，#P<0.05

3.4 Pae抑制共培養(yǎng)體系中VSMCs的凋亡 LPS組與正常對照組相比，VSMCs的凋亡率顯著上升(P<0.05)；Pae各劑量組與LPS組相比，VSMCs的凋亡率均顯著降低(P<0.05)，且呈現(xiàn)濃度依賴性，說明Pae可顯著抑制VSMCs的凋亡；TNF-α抑制劑組與LPS組比，VSMCs的凋亡率明顯降低(P<0.05)，說明共培養(yǎng)體系中TNF-α水平降低會導(dǎo)致VSMCs的凋亡受抑制。見圖4。

注：與正常對照組[Pae(-)、LPS(-)、TNF-α抑制劑(-)組]比較，*P<0.05；與LPS組[Pae(-)、LPS(+)、TNF-α抑制劑(-)組]比較，#P<0.05

3.5 VECs與VSMCs共培養(yǎng)體系的建立 VSMCs單培養(yǎng)LPS組與正常對照組比較，VSMCs凋亡率顯著上升(P<0.05)；VECs-VSMCs共培養(yǎng)LPS組與VSMCs單培養(yǎng)LPS組比較，VSMCs凋亡顯著上升(P<0.05)；VSMCs單培養(yǎng)Pae組VSMCs凋亡率顯著低于VSMCs單培養(yǎng)LPS組(P<0.05)；VECs-VSMCs共培養(yǎng)Pae組VSMCs凋亡率顯著低于VSMCs單培養(yǎng)Pae組(P<0.05)。見圖5。說明VECs-VSMCs共培養(yǎng)時Pae對VSMCs凋亡的抑制作用比VSMCs單培養(yǎng)時更明顯，證實(shí)Pae可能通過影響VECs而間接抑制VSMCs的凋亡，同時也驗(yàn)證共培養(yǎng)體系的建立成功，VECs與VSMCs之間存在相互作用。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與VSMCs單培養(yǎng)LPS組比較，#P<0.05；與VSMCs單培養(yǎng)Pae組比較，△P<0.05；A.正常對照組；B. VSMCs單培養(yǎng)LPS組；C. VECs-VSMCs共培養(yǎng)LPS組；D. VSMCs單培養(yǎng)Pae組；E. VECs-VSMCs共培養(yǎng)Pae組

3.6 Pae抑制共培養(yǎng)體系中VSMCs p38 MAPK通路及凋亡效應(yīng)蛋白表達(dá) 從圖6A和6B中可見，LPS組與正常對照組比較，p-MKK3/6、p-p38、p53和活化的caspase-3蛋白水平顯著增加(P<0.05)，

說明LPS可以誘導(dǎo)共培養(yǎng)體系中VSMCs p38 MAPK信號通路和凋亡相關(guān)蛋白的激活。Pae作用后各蛋白水平顯著降低(P<0.05)，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，說明Pae可以抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs p38 MAPK信號通路和凋亡相關(guān)蛋白的激活。TNF-α抑制劑組與LPS組比較，各蛋白水平均顯著下降(P<0.05)，說明共培養(yǎng)體系中TNF-α水平下降會導(dǎo)致VSMCs的凋亡減少。從圖6C中可見，p38 MAPK通路抑制劑SB203580組與LPS組比較，凋亡相關(guān)蛋白p53和活化的caspase-3水平均顯著下降(P<0.05)，說明p38 MAPK通路抑制會導(dǎo)致VSMCs的凋亡減少。由此得出結(jié)論：Pae通過減少VECs中TNF-α的分泌，抑制與其共培養(yǎng)的VSMCs p38 MAPK信號通路，降低凋亡相關(guān)蛋白水平，最終抑制VSMCs凋亡。

4 討論

VECs功能失調(diào)和損傷是AS形成的始動環(huán)節(jié)，LPS作為微生物感染的主要致病因素，在VECs損傷以及AS的病變形成中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，正常的VECs在顯微鏡下為短梭形或多角形，大小均勻，胞核清晰，邊界清晰，呈典型的單層鋪路石樣鑲嵌排列。LPS刺激后，顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)梭形改變，長寬比明顯增加，變?yōu)槌衫w維細(xì)胞狀，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞內(nèi)形成空泡，細(xì)胞間裂隙明顯加寬，MTT結(jié)果顯示細(xì)胞存活率顯著降低；而預(yù)先給予Pae保護(hù)后，再加入LPS刺激VECs，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變，并且細(xì)胞存活率與LPS組相比顯著增加。有報道顯示，LPS可以與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，誘導(dǎo)VECs釋放多種細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)。在LPS損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，ICAM-1水平上升，促使單核細(xì)胞聚集黏附并遷移至血管壁或血管外間隙，同時釋放蛋白酶類和氧自由基，致使組織損傷[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS可以顯著刺激VECs中TNF-α的分泌，而Pae能有效保護(hù)LPS所致的VECs炎性損傷。

注:與正常對照組[Pae(-)、LPS(-)、TNF-α抑制劑或SB203580(-)組]比較,*P<0.05;與LPS組[Pae(-)、LPS(+)、TNF-α抑制劑或SB203580(-)組]比較,#P<0.05;A. TNF-α抑制劑對p38 MAPK通路蛋白表達(dá)的影響及Pae的干預(yù)作用;B. TNF-α抑制劑對凋亡效應(yīng)蛋白表達(dá)的影響及Pae的干預(yù)作用;C. p38 MAPK通路抑制劑對凋亡效應(yīng)蛋白表達(dá)的影響及Pae的干預(yù)作用圖6 Pae抑制VSMCs p38 MAPK通路及凋亡效應(yīng)蛋白表達(dá)(x±s,n=3)

VSMCs是構(gòu)成血管壁的重要組成成分，其凋亡的發(fā)生與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。VSMCs凋亡使粥樣斑塊中纖維帽細(xì)胞數(shù)量減少，間質(zhì)膠原纖維合成減少，斑塊穩(wěn)定性下降，易發(fā)生破裂，導(dǎo)致心血管事件發(fā)生。在AS斑塊處的VECs、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞由于炎性反應(yīng)和免疫作用會產(chǎn)生各種炎性因子，誘導(dǎo)VSMCs凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：LPS損傷的VECs將釋放炎性因子TNF-α，加入TNF-α抑制劑以后，體系中TNF-α被結(jié)合，阻斷了其與細(xì)胞表面TNF受體的結(jié)合，降低TNF-α活性，VSMCs的凋亡率便有顯著下降，說明VSMCs凋亡與VECs釋放的TNF-α密切相關(guān)。Pae預(yù)保護(hù)后，可以減少VECs分泌的TNF-α，從而使得VSMCs中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)減少，凋亡率下降。

為了最大程度地模擬體內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，觀察VECs與VSMCs之間的相互作用，筆者采用膜孔徑為0.4 μm的Transwell小室建立VECs與VSMCs共培養(yǎng)模型。有報道顯示，共培養(yǎng)中VECs主要通過分泌各種細(xì)胞因子影響VSMCs的生長[16-17]。本實(shí)驗(yàn)在Transwell膜上室培養(yǎng)VSMCs，下室培養(yǎng)VECs，研究VECs分泌炎性因子TNF-α，對上室VSMCs凋亡的影響。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，LPS作用后，VECs-VSMCs共培養(yǎng)中VSMCs的凋亡率顯著高于單培養(yǎng)VSMCs；Pae作用后，VECs-VSMCs共培養(yǎng)中VSMCs的凋亡率明顯低于單培養(yǎng)VSMCs，說明共培養(yǎng)體系建立成功，VECs與VSMCs間存在相互作用，影響VSMCs的凋亡。因此也證實(shí)Pae可以通過保護(hù)損傷的VECs，減少其釋放TNF-α，間接抑制VSMCs的凋亡。

p38 MAPK信號通路是哺乳動物MAPK信號通路中一條經(jīng)典途徑，通過多級激酶的級聯(lián)反應(yīng)把細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)傳遞，在調(diào)控細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要的作用。其級聯(lián)反應(yīng)需要3個關(guān)鍵激酶：MAPKKK，MAPKK(MKK3和MKK6)以及MAPK。因此本實(shí)驗(yàn)檢測p-MKK3/6及p-p38蛋白的相對表達(dá)水平，以此來反映p38 MAPK信號通路的活性。激活p38 MAPK信號通路的因素有紫外線、促炎因子(TNF-α、IL-1)、缺血/再灌注、高滲環(huán)境、熱損傷、LPS、抗腫瘤藥物、生理應(yīng)激等[18]，這些因素通過激活MAPKKK，隨后激活MKK3/6，最終使p38被激活[19]。p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)下游蛋白p53活化，調(diào)節(jié)與凋亡相關(guān)的基因，引起細(xì)胞凋亡效應(yīng)因子caspase-3發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，切割某些重要蛋白質(zhì)，引起細(xì)胞凋亡。caspase-3是最重要的凋亡效應(yīng)因子，是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟及一切凋亡信號傳導(dǎo)的共同通路蛋白[20]。正常狀況下，caspase-3以無活性的procaspase-3形式存在，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時，它被剪切為cleaved caspase-3而變?yōu)榛钚孕问?，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示：Pae作用后，減少LPS誘導(dǎo)的VECs分泌TNF-α水平，VSMCs中p38 MAPK信號通路受到抑制，p-p53、cleaved caspase-3蛋白水平降低，VSMCs凋亡率明顯降低。

綜上所述，Pae減少VECs炎性分泌的作用將會影響VSMCs中p38 MAPK信號通路，最終抑制其凋亡。