洪世忠，施哲媛，何 帆，張 盛，陳衛(wèi)東

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

左歸飲是滋陰補(bǔ)腎的常用方劑，出自《景岳全書》，由熟地黃、山藥、枸杞子、山茱萸、茯苓和炙甘草組成。方中熟地黃是君藥，味甘，性微溫，歸肝腎經(jīng)，具有補(bǔ)血滋陰、填精益髓的功效；山茱萸是臣藥，其味酸、澀，性微溫，歸肝、腎經(jīng)。左歸飲在臨床上應(yīng)用廣泛，對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征、足跟痛、干燥綜合征、眩暈證等疾病均有良好療效[1-8]，尤其能改善圍絕經(jīng)期綜合征的臨床癥狀，具有延緩衰老的作用[9]。目前，鮮有左歸飲對(duì)細(xì)胞色素氧化酶P450在體內(nèi)代謝活性影響的文獻(xiàn)報(bào)道[10]。CYP2是細(xì)胞色素氧化酶P450的主要組成之一，參與43%的藥物代謝[11]，且有報(bào)道表明左歸飲或其組分與Cyp2b6、Cyp2c8、Cyp2c9活性密切相關(guān)[12-14]。大鼠體內(nèi)與之對(duì)應(yīng)的酶是Cyp2b1、Cyp2c7和Cyp2c11[15]。基于此，本實(shí)驗(yàn)采用Cocktail探針?biāo)幬锓╗16]，分別選用安非他酮、奧美拉唑[17]、阿莫地喹3種探針?biāo)幬?，研究左歸飲對(duì)大鼠肝臟中主要代謝酶活性的影響，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 藥材與試劑 熟地黃(河南，批號(hào) 161216)、山茱萸(浙江，批號(hào) 1701161)，炙甘草(甘肅，批號(hào) 160228)、山藥(河南，批號(hào) 161223)、茯苓(安徽，批號(hào) 160506)、枸杞子(寧夏，批號(hào) 161017)。以上藥材飲片均由安徽普仁中藥飲片有限公司提供，所有藥材經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定。超純水：安徽中醫(yī)藥大學(xué)自制；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)：上海星可高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

1.2 儀器 Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；AB SCIEX4500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)AB SCIEX公司；AB135-S電子分析天平：德國(guó)METTLER TOLEDO公司。

1.3 動(dòng)物 32只SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(皖)2011-002]提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±2)℃，濕度為50%±10%。

2 方法

2.1 左歸飲供試品的制備 根據(jù)《景岳全書》記載，稱取熟地黃(9 g)、山藥(6 g)、枸杞子(6 g)、炙甘草(3 g)、茯苓(4 g)、山茱萸(3 g)。按傳統(tǒng)湯劑煎煮工藝，藥材煎煮前用10倍水浸泡30 min，待煮沸后開始計(jì)時(shí)，溫火煎30 min，后將藥液倒出；另加6倍量水煮沸后開始計(jì)時(shí)，20 min后合并兩次藥液，濃縮至生藥量為1.0 g/mL。

2.2 溶液配制 分別精密稱取安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹標(biāo)準(zhǔn)品12.77、12.07、11.96 mg，置于50 mL容量瓶中，精密量取0.5 mL無水乙醇加入容量瓶中，用生理鹽水定容至刻度，混勻，超聲，配成0.2 mg/mL的Cocktail混合探針?biāo)幬锶芤骸，F(xiàn)配現(xiàn)用，給藥劑量為1.0 mg/kg。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液配制 精密稱取格列苯脲標(biāo)準(zhǔn)品4.00 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，配成400 μg/mL格列苯脲溶液，精密吸取適量，甲醇溶解，渦旋混勻，配成500 ng/mL內(nèi)標(biāo)格列苯脲溶液。

2.4 動(dòng)物給藥及血樣采集 將32只SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為左歸飲高劑量(31 g/kg)、中劑量(20.67 g/kg)、低劑量(13.78 g/kg)組和空白對(duì)照組。每天清晨按高、中、低劑量灌胃給予左歸飲溶液，空白組每日清晨按200 g/mL給予生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥14 d，第14天給藥后30 min，每一組均按1.0 mg/kg給藥劑量尾靜脈注射Cocktail探針?biāo)幬锓悄俏鞫?、安非他酮、阿莫地喹混合溶液。在給予大鼠Cocktail探針?biāo)幬锘旌先芤汉?、5、10、15、30、45 min，1、2、4、6、8 h，分別由眼底靜脈叢取血0.2 mL至肝素化離心管中，3 500 r/min離心10 min分離血漿，貯存于-80 ℃冰箱待測(cè)。

2.5 血漿樣品處理方法 精密量取血漿樣品100 μL置于離心管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)格列苯脲溶液，再加入300 μL甲醇，渦旋10 min，15 000 r/min離心15 min，取上清液100 μL于進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)樣量為2 μL。

2.6 色譜和質(zhì)譜條件

2.6.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A相)-乙腈(B相)；梯度洗脫：0.01～1 min為90% A→20% A，1～1.3 min為20% A，1.3～2.0 min為20% A→5% A,2.0～3.0 min為5% A→10% A，3.0～3.5 min為10% A，3.5～5 min為10% A→90% A；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；柱溫為30 ℃。

2.6.2 質(zhì)譜條件 離子化方式：電噴霧離子化(ESI)，多反應(yīng)離子檢測(cè)(MRM)，正離子模式檢測(cè)；毛細(xì)管電壓：3.60 kV；離子源溫度：400 ℃；去溶劑化溫度：500 ℃；噴霧氣為氮?dú)?，碰撞氣為氬氣。安非他酮m/z為240.0/183.9，奧美拉唑m/z為346.1/197.9，阿莫地喹m/z為356.3/283.0，內(nèi)標(biāo)格列苯脲m/z為493.9/169.1。

2.7 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的探針?biāo)幬镅帩舛?，用DAS 2.0軟件計(jì)算AUC、t1/2、CL等藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 專屬性考察 取6只大鼠的空白血漿混合液、Cocktail溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，混合的空白血漿加入Cocktail溶液、內(nèi)標(biāo)溶液，大鼠灌胃左歸飲后的血漿樣品，大鼠尾靜脈注射Cocktail溶液后的血漿樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法處理樣品，采用液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析。如圖1所示，大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)基本不干擾混合探針底物及內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)，大鼠空白血漿添加Cocktail溶液與給藥后血樣的行為一致。

3.2 線性范圍考察 精密吸取大鼠空白血漿100 μL，各加入一系列不同濃度Cocktail溶液10 μL，制備成安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹的系列濃度血漿樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)(C)，對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比作為縱坐標(biāo)(f)，繪制各底物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，安非他酮線性回歸方程為f=0.062 4C+0.207 3(r=0.998 8)，線性范圍為5～600 ng/mL；奧美拉唑的線性回歸方程為f=0.090 5C+0.173 6(r=0.998 8)，線性范圍為5～800 ng/mL；阿莫地喹的線性回歸方程為f=0.105 7C+0.066 8(r=0.999 0)，線性范圍為0.5～200 ng/mL。

3.3 精密度和準(zhǔn)確度考察 以SD大鼠空白血漿進(jìn)行精密度和準(zhǔn)確度(即相對(duì)回收率)考察，取適量混合探針底物溶液，配制5份探針底物最低定量下限濃度(lower limit of quantitation, LLOQ)、低濃度(low concentration quality control sample, LQC)、中濃度(middle concentration quality control sample, MQC)、高濃度(high concentration quality control sample, HQC)質(zhì)控樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，按“2.6.1”項(xiàng)下LC-MS/MS檢測(cè)方法進(jìn)樣，分別于一日內(nèi)測(cè)定及連續(xù)3 d內(nèi)測(cè)定3次，記錄峰面積，計(jì)算各探針底物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入“3.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得各探針底物的濃度，計(jì)算實(shí)際測(cè)定量與加入量的比值，進(jìn)而計(jì)算準(zhǔn)確度及日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果表明，該方法測(cè)定探針底物血漿樣品的日內(nèi)及日間精密度均良好，滿足生物樣品分析要求。

3.4 基質(zhì)效應(yīng)考察 取來自不同個(gè)體的大鼠空白血漿100 μL，分別加入一系列不同濃度的探針底物混合溶液10 μL，配制成含安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹的LQC、MQC、HQC標(biāo)準(zhǔn)添加SD大鼠的血漿樣本，每個(gè)濃度平均配制6份，之后按“2.5”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，按“2.6.1”項(xiàng)下LC-MS/MS方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹的峰面積均為A1。另用100 μL水代替SD大鼠空白血漿，其他步驟同上，記錄安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹的峰面積均為A2，則安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹的基質(zhì)效應(yīng)均為(A1/A2)×100%。采用相同方式計(jì)算內(nèi)標(biāo)格列苯脲峰面積并計(jì)算其基質(zhì)效應(yīng)。由結(jié)果可知，探針底物及內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)均為95%～105%，即離子效應(yīng)對(duì)本方法的測(cè)定結(jié)果無影響，基本滿足底物定量分析的要求。

注：A.空白血漿色譜圖；B.空白血漿加探針底物及內(nèi)標(biāo)溶液色譜圖；C.大鼠尾靜脈注射探針底物后探針底物及內(nèi)標(biāo)色譜圖；Ⅰ.阿莫地喹；Ⅱ.安非他酮；Ⅲ.奧美拉唑；Ⅳ.格列本脲

圖1大鼠血漿中探針底物及內(nèi)標(biāo)的UPLC-MS/MS圖

3.5 穩(wěn)定性考察 血漿樣品穩(wěn)定性主要利用探針底物L(fēng)QC、HQC這兩個(gè)質(zhì)控樣品濃度考察SD大鼠血漿樣品的短期穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性，其中短期穩(wěn)定性包括自動(dòng)進(jìn)樣器穩(wěn)定性、室溫放置穩(wěn)定性、反復(fù)凍融穩(wěn)定性，自動(dòng)進(jìn)樣器穩(wěn)定性考察的是樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h的穩(wěn)定性，而室溫放置穩(wěn)定性考察的是樣品在室溫條件下放置2 h的穩(wěn)定性，凍融穩(wěn)定性主要考察樣品凍融3次的穩(wěn)定性，血漿樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定性是指血漿樣品在-80 ℃冰箱放置20 d的穩(wěn)定性。在測(cè)定安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹這3個(gè)儲(chǔ)備液穩(wěn)定性的考察中均表現(xiàn)出穩(wěn)定性良好，滿足生物樣品分析條件。

4 藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)

4.1 探針?biāo)幬锏难帩舛?時(shí)間曲線 采用高、中、低劑量左歸飲溶液對(duì)大鼠灌胃14 d后，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，測(cè)得3種探針?biāo)幬锏难帩舛炔@得血藥濃度-時(shí)間曲線。

4.1.1 阿莫地喹血藥濃度-時(shí)間曲線 實(shí)驗(yàn)組和空白組大鼠尾靜脈注射Cocktail探針?biāo)幬锶芤褐?，測(cè)得探針?biāo)幬锇⒛剜难帩舛?，擬合的大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

圖2 阿莫地喹在大鼠體內(nèi)的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

4.1.2 安非他酮的血藥濃度-時(shí)間曲線 實(shí)驗(yàn)組和空白組大鼠尾靜脈注射Cocktail探針?biāo)幬锶芤褐?，測(cè)得探針?biāo)幬锇卜撬难帩舛?，擬合的大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3。

4.1.3 奧美拉唑的血藥濃度-時(shí)間曲線 實(shí)驗(yàn)組和空白組大鼠尾靜脈注射Cocktail探針?biāo)幬锶芤褐?，測(cè)得探針?biāo)幬飱W美拉唑的血藥濃度，擬合的大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖4。

4.2 探針?biāo)幬锏乃幬锎x動(dòng)力學(xué)參數(shù) 各種成分的藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)中國(guó)藥理學(xué)會(huì)推薦的DAS 2.0程序進(jìn)行處理、擬合，計(jì)算阿莫地喹、安非他酮、奧美拉唑3種探針?biāo)幬锏纳锇胨テ?biological half life，t1/2)、清除率(clearance，CL)、藥-時(shí)曲線下面積(area under the curve，AUC)、表觀分布容積(apparent volume of distribution，V)等。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

圖3 安非他酮在大鼠體內(nèi)的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

圖4 奧美拉唑在大鼠體內(nèi)的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

4.2.1 左歸飲對(duì)阿莫地喹在大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響 阿莫地喹為Cyp2c7酶的特異性探針底物。左歸飲高、中、低劑量組與空白組比較，阿莫地喹的主要藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示左歸飲高、中、低劑量連續(xù)給藥對(duì)大鼠體內(nèi)Cyp2c7并無顯著的影響。具體藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。

表1 左歸飲對(duì)阿莫地喹在大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

4.2.2 左歸飲對(duì)安非他酮在大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響 安非他酮為Cyp2b1酶的特異性探針底物。左歸飲高、中、低劑量組與空白組比較，安非他酮的主要藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示左歸飲高、中、低劑量連續(xù)給藥對(duì)大鼠體內(nèi)Cyp2b1并沒有顯著的影響。具體藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。

4.2.3 左歸飲對(duì)奧美拉唑在大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響 奧美拉唑?yàn)镃yp2c11酶的特異性探針底物。左歸飲高、中、低劑量組與空白組比較，奧美拉唑的主要藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示左歸飲高、中、低劑量連續(xù)給藥對(duì)大鼠體內(nèi)Cyp2c11并無顯著的影響。具體的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。

5 討論

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》，左歸飲的給藥劑量按體表面積折算，大鼠的用藥劑量是人類臨床用藥劑量的6倍，以此計(jì)算出大鼠服用左歸飲的高、中、低劑量分別為31、20.67、13.78 g/kg。因?yàn)樵谂R床上左歸飲的給藥方式大多為煎服，所以本研究也采用與人體用藥方式最接近的灌胃給藥。

表2 左歸飲對(duì)安非他酮在大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

表3 左歸飲對(duì)奧美拉唑在大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

左歸飲水溶性成分包括多糖、馬錢苷、5-羥甲基糠醛、梓醇等[18]。復(fù)方左歸飲組成中，炙甘草的主要有效成分為甘草酸類及黃酮類化合物，補(bǔ)脾益氣，抗疲勞和抗氧化作用更明顯。枸杞子的主要化學(xué)成分枸杞多糖和甜菜堿，具有補(bǔ)肝益腎的功效。熟地黃中含有地黃苷A、地黃苷D、毛蕊花糖苷3種有效成分，能夠補(bǔ)血滋陰、益精填髓。山茱萸總苷有良好的抗炎和免疫抑制作用，熊果酸是山茱萸發(fā)揮抑菌作用的有效成分，其和齊墩果酸對(duì)鏈脲霉素造成的糖尿病大鼠有降血糖作用[19]，山茱萸中維生素C、維生素E和硒等有清除自由基和延緩衰老作用[20]。山藥中有效成分包含皂苷、多糖、黃酮類物質(zhì)、尿囊素等。WANG等[21]得出茯苓醇提物中主要含有羊毛甾烷型三萜如茯苓新酸B、茯苓新酸A。

本實(shí)驗(yàn)采用Cocktail探針?biāo)幬锓?，?duì)大鼠連續(xù)給予14 d不同劑量的左歸飲后，測(cè)定給藥組與空白組中阿莫地喹、安非他酮和奧美拉唑在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，并計(jì)算藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，評(píng)價(jià)左歸飲對(duì)大鼠細(xì)胞色素氧化酶P450不同亞型Cyp2b1、Cyp2c11和Cyp2c7體內(nèi)代謝活性的影響，為左歸飲的開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組對(duì)照，高、中、低劑量的左歸飲連續(xù)給藥對(duì)Cyp2b1、Cyp2c7和Cyp2c11酶活性的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，左歸飲聯(lián)合配伍其他藥物使用可基本忽略其對(duì)代謝酶的影響，這也與左歸飲在臨床上廣泛的配伍應(yīng)用相一致。