□ 方富良 李 娜 杭州貝因美母嬰營養(yǎng)品有限公司

泛酸又稱維生素B5、遍多酸，是一種水溶性維生素，幾乎存大于所有活細胞中。泛酸在酸、堿、光及熱等條件下都不穩(wěn)定。具有制造抗體功能，在維護頭發(fā)、皮膚及血液健康方面扮演著重要角色。目前，市場上針對特殊人群的水解蛋乳粉越來越多，其把完整的大分子蛋白進行切割，變成小分子的蛋白甚至游離的氨基酸。采用水解蛋白作為蛋白質(zhì)來源的奶粉稱為水解蛋白奶粉。由于大分子蛋白被水解成小分子，則在目前現(xiàn)有的高效液相色譜法測試泛酸的過程，蛋白小分子無法被鹽沉淀，嚴重干擾了后續(xù)樣品在液相色譜柱中的分離效果，小分子色譜峰無法與泛酸目標峰很好地進行分離。超高效液相色譜-質(zhì)譜法采用多反應(yīng)監(jiān)測模式對泛酸進行檢測，排除了小分子蛋白帶來的干擾。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用購于市場上售賣的某品牌乳蛋白深度水解配方粉；乙腈（默克，色譜純）；乙酸（國藥，GR）；甲酸（SIGMA）；泛酸鈣標準品（supelco）；同位素內(nèi)標泛酸-13C3，15N（維生素B5半鈣鹽）；水系濾膜（津騰，0.22um）。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-MS/MS（WATERS，I-CLASS+TQ-S）；ACQUITY UPLC HSS T3（WATERS，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；臺式高速冷凍離心機（湘儀，H2050R）；萬分之一電子天平（梅特勒，AL204）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，KH3200E）。

1.3 方法

1.3.1 標準品（200 μg/mL）配制

稱取泛酸鈣21.8 mg,加水溶解至100 mL容量瓶（泛酸鈣換算成泛酸系數(shù)為0.92），冰箱冷藏保存。

泛酸同位素標準溶液（100 μg/mL）：稱取泛酸-13C3，15N 10 mg,加水溶解至100 mL容量瓶，冰箱冷藏保存。

1.3.2 樣品處理

稱取樣品約1 g（精確到0.000 1 g）至50 mL棕色容量瓶中，加20 mL 50～60 ℃溫水溶解，加入 1 mL乙酸溶液，超聲提取20 min。取出放置至室溫，加入250 μL同位素內(nèi)標溶液，用乙腈定容，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，放入至離心機以8 000 r/min離心5 min，取出過濾。用水進對濾液進行稀釋200倍，渦旋振蕩，用0.22 μm濾膜過濾，供上機測試。

1.3.3 測試條件

色譜柱：WATERS ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量2 μL。液動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫見表1。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式；毛細管電壓1.5 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣量800 L/h；碰撞氣流速0.14 mL/min。質(zhì)譜監(jiān)測條件見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗證

2.1.1 線性范圍、檢出限和定量限

準確吸取泛酸標準溶液，分別添加泛酸同位素標準溶液，用水稀釋成濃度為0.5～10 ng/mL的標準工作液，以峰面積比和同位素濃度的乘積為縱從標、泛酸標準濃度為橫從標，繪投影標準曲線。結(jié)果表明，泛酸在0.5～10 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。線性回歸方程為y=1.44389x+1.14868，相關(guān)系數(shù)r=0.99916。根據(jù)儀器的檢出限（定量離子S/N=3）及定量下（定量離子S/N=10），結(jié)合樣品的前處理過程，計算得到方法檢出限為方法定量限，分別為0.02 mg/100 g和0.08 mg/100 g。

表1 流動相梯度洗脫條件

表2 質(zhì)譜監(jiān)測條件

表3 泛酸加標回收測試結(jié)果

2.1.2 回收率

取乳蛋白深度水解配方粉，進行3個標準添加水平的回收率實驗，每個添加水平重復測定6次，分別計算加標回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表3。泛酸3個水平的加標回收率在91.3%～103.5%，相對標準偏差在3.1%～3.5%，能夠滿足檢測實際品的要求。

3 分析結(jié)論

（1）由于樣品添加水解蛋白，無法簡單地用酸很好沉淀，本方法運用乙腈沉淀，使樣液能很好地離心過濾。

（2）相對高效液相色譜法采用質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式排除了蛋白小分子對泛酸目標峰的干擾。

（3）樣品處理過程簡單，較大的縮短了儀器測試時間，提高效率。