劉玉芳 秦桂芳

（湖北省十堰市人民醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）為一種以角質(zhì)形成細(xì)胞損害形成紅斑皮疹為主并累及心、肺、腎等組織器官的自身免疫性結(jié)締組織病，好發(fā)于15～40歲女性［1］。其中遺傳因素、性激素水平、環(huán)境改變、紫外線照射及內(nèi)分泌失調(diào)等因素均可誘發(fā)或加重LE［2］。SLE具有起病急、病情進(jìn)展快、病因病情錯(cuò)綜復(fù)雜，臨床表現(xiàn)呈多樣性的特點(diǎn)，絕大多數(shù)患者自發(fā)病起即出現(xiàn)多系統(tǒng)多器官損害，且多較嚴(yán)重，患者多因長期大量使用藥物產(chǎn)生的副作用及狼瘡腦病、心肌病、狼瘡腎炎等器官損傷而危及生命［3］。因此，準(zhǔn)確診斷及積極選用有效藥物治療是挽救患者生命的重要手段。目前批準(zhǔn)用于臨床治療SLE的主要藥物有羥氯喹、糖皮質(zhì)激素及環(huán)磷酰胺等，這類西藥在治療SLE時(shí)具有起效快的優(yōu)點(diǎn)，但同也存在復(fù)發(fā)率高、毒副作用多等缺點(diǎn)［4］。而中醫(yī)中藥雖在治療時(shí)起效慢、但卻具有價(jià)格便宜、取材方便及復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點(diǎn)，故在臨床治療SLE時(shí)可在西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上加用中草藥或中藥單體以提高臨床療效。雷公藤為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，其性苦、寒，具有舒筋活血、祛風(fēng)通絡(luò)、清熱解毒等功效［5］。目前對(duì)雷公藤治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕等的研究較為全面，但對(duì)治療SLE機(jī)制，尤其是針對(duì)與SLE發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的濾泡性輔助T淋巴細(xì)胞（Tfh細(xì)胞）及其下游系列的免疫反應(yīng)的影響研究甚少。本研究以與人類SLE具有性別偏好性一致且與SLE病理極其相似的BALB/c小鼠誘發(fā)性紅斑狼瘡模型來觀察和研究雷公藤對(duì)SLE的影響，為臨床用藥提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性Balb/c小鼠48只，體質(zhì)量（18.5±1.0） g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（鄂）2016-008，實(shí)驗(yàn)操作在十堰市人民醫(yī)院科研中心的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室完成，所有操作均按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 藥物及試劑 雷公藤內(nèi)酯醇片（上海柘智生物科技有限公司，批號(hào)：38748-32-2）；硫酸羥氯喹片（上海中西制藥有限公司，批號(hào)：B14200158270）；酶聯(lián)免疫吸附法白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-21（IL-21）、白細(xì)胞介素-27（IL-27）、雙鏈 DNA 抗體（ds-DNA）、免疫球蛋白G（IgG）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、濾泡歸巢趨化因子（CXCL13）檢測試劑盒（上海吉泰依科賽生物科技有限公司，批號(hào)：EH18072，EH18073，EH18076，01824，1724，EH2307，EH18025）。 血管內(nèi)皮生長因子受體1（VEGFR1）和鼠抗人CXCR5單克隆抗體（上海安研商貿(mào)有限公司，批號(hào)h01834）。

1.3 造模與分組 參照文獻(xiàn)［6］，所有動(dòng)物（共48只）均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將其中的36只雌性 BALB／c小鼠隨機(jī)均分為模型組、羥氯喹組和雷公藤組。均采用單次腹腔注射Pristane（0.5 mL/鼠）的方法建立誘發(fā)性紅斑狼瘡模型，另12只單次腹腔注射0.9%氯化鈉注射液并設(shè)為對(duì)照組。每周觀察小鼠皮膚及生長狀況改變，在注射第3個(gè)月后，以小鼠出現(xiàn)邊際侵蝕、骨膜炎和（或）滑膜增生等類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀、血清可檢測出ds-DNA顯著上升并伴有腎小球IgG沉積、細(xì)胞因子IL-6、IL-21、IL-27 水平升高為成模標(biāo)準(zhǔn)［7］。

1.4 給藥方法 將硫酸羥氯喹片和雷公藤內(nèi)酯醇片研碎，用0.9%氯化鈉溶液配制成1%藥液備用。造模成功后，根據(jù)人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量換算公式計(jì)算得出各組動(dòng)物的給藥劑量，經(jīng)計(jì)算，羥氯喹組按1.0 mg/kg灌胃1%硫酸羥氯喹藥液，雷公藤組按1.5 mg/k灌胃1%雷公藤內(nèi)酯醇藥液，模型組按1.0 mg/kg灌胃0.9%氯化鈉溶液。所有動(dòng)物均每日1次灌胃，治療4周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 于末次給藥后采小鼠眶靜脈血0.1 mL檢測各項(xiàng)指標(biāo)。標(biāo)本的檢測方法以血清濾泡性輔助T淋巴細(xì)胞 （Tfh細(xì)胞）表面標(biāo)記物CXCR5及其配體CXCL13的檢測方法和步驟為例說明如下。先取2管EDTA抗凝靜脈血 （每管50 μL），分別加入CXCR5單克隆抗體和陰性對(duì)照抗體10 μL，避光4℃孵育，30 min后加入250 μL溶血?jiǎng)覝胤胖?0 min后鞘液離心洗滌，去上清，加500 μL鞘液重懸，10 min后上流式細(xì)胞儀，常規(guī)操作，用流式細(xì)胞儀配套的軟件進(jìn)行分析，得出CXCR5在靜脈血CD19+B細(xì)胞中的表達(dá)。血清中CXCL13含量采用ELISA法檢測檢：先配制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)，振蕩混勻后取50 μL加入酶標(biāo)板反應(yīng)孔。然后取EDTA抗凝靜脈血50 μL，4℃靜置30 min，然后離心力調(diào)至1000×g，離心10 min，迅速分離血清與紅細(xì)胞后取上清50 μL加入酶標(biāo)板反應(yīng)孔，立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的相應(yīng)抗體。蓋板，振蕩、混勻，37℃溫育60 min。甩去液體，加滿洗滌液并振蕩30 s，甩去酶標(biāo)板反應(yīng)孔洗滌液，拍干，重復(fù)以上操作3次。然后每孔加入80 μL親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩、混勻，37℃溫育30 min?？變?nèi)加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，拍干，重復(fù)操作3次。加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩、混勻，37℃溫育10 min。避光取出酶標(biāo)板，加50 μL終止液并立即上機(jī)待測樣本中CXCL13含量。檢測時(shí)用美國Bio-Rad公司的Bio-Rad450型酶標(biāo)儀于450nm波長處讀取各孔OD值，以吸光度OD值為縱坐標(biāo) （Y軸），CXCL13標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X軸），得出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中CXCL13的含量根據(jù)其OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出CXCL13相應(yīng)濃度。細(xì)胞因子 IL-6、IL-21、IL-27、雙鏈 DNA 抗體（ds-DNA）滴度（ds-DNA）及免疫球蛋白G（IgG）檢測均參考以上方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行試驗(yàn)。取小鼠腹腔內(nèi)脂肪肉芽腫結(jié)節(jié)病理組織2mg，制成組織勻漿液，參考以上方法，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體1（VEGFR1）相應(yīng)的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)檢驗(yàn)先進(jìn)行多因素方差分析，符合正態(tài)分布的組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的組間兩兩比較采用校正LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠CXCR5、CXCL13、血清抗ds-DNA抗體滴度、IgG比較 見表1。模型組CXCR5低表達(dá)，CXCL13水平、抗ds-DNA抗體滴度、IgG均顯著升高，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。羥氯喹組模型組CXCR5呈高表達(dá)，CXCL13水平、抗ds-DNA抗體滴度、IgG均顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＜0.05）。雷公藤組作用與羥氯喹組相似，CXCR5呈高表達(dá)，CXCL13水平、抗ds-DNA抗體滴度、IgG均顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與羥氯喹組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠CXCR5、CXCL13、血清抗ds-DNA抗體滴度、IgG 比較（±s）

表1 各組小鼠CXCR5、CXCL13、血清抗ds-DNA抗體滴度、IgG 比較（±s）

與對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。 下同

組 別 n CXCR5（pg/mL）CXCL13（pg/mL） 抗 ds-DNA IgG（g/L）對(duì)照組 12模型組 12羥氯喹組 12 102.74±12.73 32.78±7.54 2.14±0.27 7.70±0.54 75.36±9.02△ 126.07±10.83△ 5.90±0.62△ 10.26±1.85△98.73±8.72▲ 34.82±5.72▲ 2.83±0.35▲ 7.62±0.62▲雷公藤組 12101.02±10.48▲ 36.57±2.14▲ 2.57±0.24▲ 8.01±0.75▲

2.2 各組小鼠小鼠IL-6、IL-21、IL-27水平比較 見表2。模型組細(xì)胞因子IL-6、IL-21、IL-27均顯著升高，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。羥氯喹組模型組細(xì)胞因子IL-6、IL-21、IL-27均顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但三者均未降至對(duì)照組水平，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。雷公藤組細(xì)胞因子IL-6、IL-21、IL-27三者均降至對(duì)照組水平，與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與模型組和羥氯喹組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表 2 各組小鼠 IL-6、IL-21、IL-27 水平比較（ng/L，±s）

表 2 各組小鼠 IL-6、IL-21、IL-27 水平比較（ng/L，±s）

與羥氯喹組比較，#P＜0.05。下同

組 別 n IL-6 IL-21 IL-27對(duì)照組 12模型組 12羥氯喹組 12 0.14±0.01 0.42±0.04 0.23±0.02 28.39±3.14△ 76.07±5.89△ 45.71±3.62△2.78±0.19△▲ 3.04±0.12△▲ 1.75±0.07△▲雷公藤組 120.17±0.03▲# 0.47±0.05▲# 0.25±0.02▲#

2.3 各組小鼠腹腔內(nèi)脂肪肉芽腫結(jié)節(jié)病理組織VEGF和VEGFR1表達(dá)比較 見表3。ELISA法檢測顯示，模型組腹腔內(nèi)脂肪肉芽腫結(jié)節(jié)病理組織小鼠VEGF和VEGFR1均高表達(dá)，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。羥氯喹組VEGF和VEGFR1均有一定程度降低，但三者均未降至對(duì)照組水平，與對(duì)照組和模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。雷公藤組VEGF和VEGFR1均顯著降低，與模型組和羥氯喹組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組小鼠腹腔內(nèi)脂肪肉芽腫結(jié)節(jié)病理組織VEGF和VEGFR1 表達(dá)比較（pg/mL，±s）

表3 各組小鼠腹腔內(nèi)脂肪肉芽腫結(jié)節(jié)病理組織VEGF和VEGFR1 表達(dá)比較（pg/mL，±s）

組 別 n VEGF VEGFR1對(duì)照組 12模型組 12羥氯喹組 12 33.84±5.38 19.73±3.24 213.69±27.01△ 92.12±11.75△180.70±13.39△ 81.94±6.82△雷公藤組 1238.16±5.40▲# 21.56±3.17▲#

3 討 論

SLE在中醫(yī)中無明確病名，究其病因主要為先天稟賦之不足，脾虛后天虧乏，產(chǎn)后體虛，房事不節(jié)，外感六淫、毒邪，外感內(nèi)傷合而致全身各種組織、器官中炎性病變［8］。且目前對(duì)SLE的辨證分型尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，筆者參照文獻(xiàn)，根據(jù)臨床表現(xiàn)將SLE分為陰血虛虧、邪熱傷肝、熱毒熾盛、毒邪攻心、腎陰虧損等［9］。而從西醫(yī)發(fā)病機(jī)制分析，SLE發(fā)病涉及遺傳、雌激素受體、單核吞噬細(xì)胞、各種自身抗體、Ts細(xì)胞功能降低、Th細(xì)胞和B細(xì)胞功能亢進(jìn)、多種細(xì)胞因子參與、補(bǔ)體及其受體清除功能障礙等因素，且至今對(duì)SLE的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，因此研究上述影響因素及相關(guān)藥物對(duì)治療SLE 有重要意義［10］。

Pristane是一種可引起細(xì)胞死亡及各類細(xì)胞因子分泌異常、細(xì)胞膜脂非特異性炎癥反應(yīng)并造成多種細(xì)胞質(zhì)抗原和自身核抗原的形成，是目前常用的誘發(fā)小鼠SLE細(xì)胞膜活性物質(zhì)［11］。本研究用Pristane誘發(fā)BALB/c小鼠產(chǎn)生誘發(fā)性紅斑狼瘡，系統(tǒng)觀察了中藥單體雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)其血清Tfh細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)及腹腔內(nèi)脂肪肉芽腫結(jié)節(jié)病理組織改變的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組血清CXCR5呈低表達(dá)，CXCL13水平、抗ds-DNA抗體滴度、IgG、細(xì)胞因子IL-6、IL-21、IL-27均顯著升高，腹腔內(nèi)脂肪肉芽腫結(jié)節(jié)病理組織中VEGF及VEGFR1的高表達(dá)，說明這種造模方法可行，結(jié)果真實(shí)，與人類SLE極為相似。模型組靜脈血CD19+B細(xì)胞上CXCR5呈低表達(dá)可能是在高表達(dá)的CXCL13趨化 作用下從T細(xì)胞區(qū)遷移到B細(xì)胞濾泡定居有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中用治療SLE的主要藥物硫酸羥氯喹片作為陽性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)硫酸羥氯喹片對(duì)腹腔內(nèi)脂肪肉芽腫結(jié)節(jié)病理組織中VEGF及VEGFR1的表達(dá)無明顯影響。硫酸羥氯喹片為免疫調(diào)節(jié)劑，主要用于治療類風(fēng)濕、SLE等自身免疫性結(jié)締組織?。?2］。而雷公藤組除有與陽性藥硫酸羥氯喹片相同的提高CXCR5、降低CXCL13水平、抗ds-DNA抗體滴度及細(xì)胞因子IL-6、IL-21、IL-27的作用外，還可顯著降低腹腔內(nèi)脂肪肉芽腫結(jié)節(jié)病理組織中VEGF及VEGFR1的表達(dá)。這充分證實(shí)雷公藤內(nèi)酯醇還可以阻斷VEGF與其受體VEGFR1結(jié)合，使病變組織內(nèi)血管新生減少，這在一定程度上可以減輕受試動(dòng)物病理進(jìn)程，因此，我們認(rèn)為這可能是治療SLE重要途徑之一。有研究表明，VEGF可促進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜組織血管新生而加速滑膜血管翳的形成，而雷公藤可通過抑制VEGF促血管新生作用，抑制滑膜組織增生，使血管翳的形成減輕，軟骨與骨破壞也得以降低，這對(duì)阻止關(guān)節(jié)炎病程進(jìn)展起到重要作用［13-14］。而雷公藤抑制誘發(fā)性紅斑狼瘡模型小鼠腹腔內(nèi)脂肪肉芽腫結(jié)節(jié)病理組織中VEGF及VEGFR1的表達(dá)尚屬首次發(fā)現(xiàn)，這也在一定程度上證實(shí)是VEGF在SLE發(fā)病中點(diǎn)有一定的作用［15］。研究表明，Tfh細(xì)胞是一種CD4+T細(xì)胞亞群，可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、遷移、成熟，并促進(jìn)IL-6、IL-21、IL-27等細(xì)胞因子的表達(dá)，且可輔助B淋巴細(xì)胞增殖、體細(xì)胞突變及同型轉(zhuǎn)換，因此，Tfh細(xì)胞分泌的IL-6、IL-21、IL-27等細(xì)胞因子在B細(xì)胞分化及功能等方面起到核心刺激和催化作用［16］。B細(xì)胞也能分泌IL-6，而IL-6又能促進(jìn)自身反應(yīng)性B細(xì)胞的增殖并刺激其成熟，誘導(dǎo)其分化為成熟的IgG。因此，IL-6、IL-21、IL-27等細(xì)胞因子與疾病的活性密切相關(guān)，SLE患者血清細(xì)胞因子均高表達(dá)，這在臨床診斷SLE具有重要的參考價(jià)值［17-18］。Tfh細(xì)胞位于淋巴濾泡，CXCR5為CXCL13的特異性受體，在CXCL13的趨化作用下可促使Tfh細(xì)胞從外周淋巴器官T細(xì)胞區(qū)遷移到淋巴濾泡中心而與B細(xì)胞共定位和相互作用，因此，CXCR5和CXCL13均是Tfh細(xì)胞的重要的表面標(biāo)志物［19］。本實(shí)驗(yàn)中雷公藤組CXCR5呈高表達(dá)，而CXCL13水平降低，提示雷公藤內(nèi)酯醇可能通過提高CD19+B細(xì)胞上CXCR5表達(dá)，降低CXCL13水平，使CXCL13對(duì)Tfh細(xì)胞的趨化作用降低，Tfh細(xì)胞從T細(xì)胞區(qū)遷移到B細(xì)胞濾泡定居減少，對(duì)B細(xì)胞產(chǎn)生的刺激信號(hào)降低，由此引發(fā)B細(xì)胞產(chǎn)生大量自身抗體也會(huì)隨之降低。雷公藤組細(xì)胞因子IL-6、IL-21、IL-27均明顯降低，提示雷公藤內(nèi)酯醇可能通過影響的T、B細(xì)胞的活化來抑制細(xì)胞因子參與的免疫反應(yīng)，從來抑制自身免疫在SLE病理進(jìn)程中的作用，雷公藤組抗ds-DNA抗體滴度和IgG顯著降低也佐證了上述推測。而從中醫(yī)理論上分析，雷公藤屬祛風(fēng)濕類中藥，性苦、寒，有大毒，歸肝、腎經(jīng)，具有舒筋活血、祛風(fēng)通絡(luò)、清熱解毒等功效，在治療SLE時(shí)可抑制 Tfh細(xì)胞、B細(xì)胞功能異常活躍時(shí)導(dǎo)致的免疫復(fù)合物及補(bǔ)體形成，從而減輕由Tfh細(xì)胞、B細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［20-21］。

綜上所述，本研究認(rèn)為，中藥單體雷公藤內(nèi)酯醇治療SLE的機(jī)制可能通過直接抑制Tfh細(xì)胞的功能，間接抑制B細(xì)胞亢進(jìn)導(dǎo)致的IgG及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而對(duì)SLE的多個(gè)免疫環(huán)節(jié)起調(diào)節(jié)作用，其產(chǎn)生的免疫抑制作用使其在抗炎、抑制免疫排斥反應(yīng)達(dá)到治療SLE的目的。另外，雷公藤內(nèi)酯醇還可以通過下調(diào)病變組織VEGF表達(dá)，減少病變組織內(nèi)血管新生而發(fā)揮抑制SLE病理進(jìn)程。