劉 燕 趙永烈 劉金民△

（1.北京市第一中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 100026；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100000）

偏頭痛是一種發(fā)病率很高的原發(fā)性頭痛，目前我國(guó)的患病率為9.3%［1］，嚴(yán)重危害國(guó)人健康。近年研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛涉及三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)［2-4］。傷害性感受刺激三叉神經(jīng)的初級(jí)神經(jīng)元，經(jīng)三叉神經(jīng)脊束核傳入顱內(nèi)疼痛中樞 （丘腦、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)尾側(cè)腹外側(cè)區(qū)域），再傳到皮質(zhì)（島回額葉皮質(zhì)、前扣帶回）產(chǎn)生頭痛。在偏頭痛發(fā)生過(guò)程中，三叉神經(jīng)節(jié)是偏頭痛發(fā)生的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)在疼痛信息傳遞和調(diào)制中起關(guān)鍵作用，環(huán)繞血管周圍的三叉神經(jīng)末梢含有的血管活性肽類物質(zhì)（P物質(zhì)SP、降鈣素基因相關(guān)肽CGRP、神經(jīng)激肽NK、內(nèi)源性阿片肽等）可能是偏頭痛發(fā)生的關(guān)鍵病理生理環(huán)節(jié)。課題組前期復(fù)制了偏頭痛動(dòng)物模型，對(duì)川芎等中藥對(duì)偏頭痛模型的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了初步研究，現(xiàn)為了進(jìn)一步探索中藥方劑散偏湯治療偏頭痛的生物學(xué)作用機(jī)制，進(jìn)行以下研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SPF級(jí)SD大鼠24只，體質(zhì)量（200±20）g，由維通利華公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，相對(duì)溫度波動(dòng)在（22±2）℃，相對(duì)濕度在30%～40%，喂養(yǎng)常規(guī)飼料，自由進(jìn)食飲水。

1.2 試藥與儀器

1）試藥。散偏湯顆粒劑（組成：川芎 30 g，白芍15 g，白芷 10 g，白芥子 10 g，柴胡 10 g，制香附 10 g，郁李仁6 g，生甘草3 g。購(gòu)自北京市第一中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江陰天江藥業(yè)有限公司，檢驗(yàn)批號(hào)：白芍1707031、香附 1706138、川芎 1701019、郁李仁 1611050、柴胡1705123、白芥子 1609007、甘草 1706018、白芷 1611077）；硝酸甘油注射液（5 mg/mL，北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：H11020289。琥珀酸舒馬普坦，天津華津制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040700）；TRNzol總RNA提取試劑［天根生化科技（北京）有限公司DP405-02］；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa（寶生物）RR047B）；SYBRTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）， ROX plus［TaKaRa（寶生物）RR82LR］；DL2，000 DNA Marker（TaKaRa（寶生物）3427Q）引物合成（Invitrogen）；CGRP 兔多抗（Abcam ab47027）；βactin 鼠單抗（Immunoway YM3028）。 2）儀器。 Thermo Fresco21低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾Thermo公司）；Thermo MultiSkan3酶標(biāo)儀 （美國(guó)賽默飛世爾Thermo公司）；Cavoy Mini P-4電泳槽 （北京凱元信瑞儀器有限公司）；Cavoy濕轉(zhuǎn)電泳槽 （北京凱元信瑞儀器有限公司）；Bio-Rad電泳儀 （美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad公司）；其林貝爾水平脫色搖床 （其林貝爾脫色搖床公司）；Hanna酸度計(jì) pH211（意大利哈納HANNA公司）；Fluka電動(dòng)組織勻漿器 （美國(guó) Fluka公司）；FlukaQL-902渦旋振蕩儀 （美國(guó) Fluka公司）；Centrifuge 5415D離心機(jī) （德國(guó) Eppendorf公司）；NANODROP 2000分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾Thermo公司）；凝膠成像系統(tǒng)Tanon 1600（山東灝洋實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司）；ABI7500熒光定量PCR儀（美國(guó)賽默飛世爾Thermo公司）。

1.3 動(dòng)物分組

24只大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、偏頭痛模型組、琥珀酸舒馬普坦組、散偏湯組，每組6只。

1.4 模型制備及干預(yù)方法

動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行造模及干預(yù)。1）生理鹽水組：大鼠頸背部皮下注射2 mL/kg 0.9%氯化鈉注射液，每周1次，連續(xù)3周，于第2次注射0.9%氯化鈉注射液后給予10 mL/（kg·d）0.9%氯化鈉注射液灌胃，普通飼養(yǎng)。2）偏頭痛模型組：大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油 10 mg/kg（5 mg/mL）造模，每周 1次，連續(xù) 3周，于第2次注射硝酸甘油后給予10 L/（kg·d）0.9%氯化鈉注射液灌胃，共1周，普通飼養(yǎng)。3）琥珀酸舒馬普坦組：大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg（5 mg/mL）造模，每周1次，連續(xù)3周，于第2次注射硝酸甘油后給予琥珀酸舒馬普坦 6 mg/（kg·d）灌胃，共 1 周，普通飼養(yǎng)。4）散偏湯組：大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油溶液10 mg/kg（5 mg/mL）造模，每周 1 次，連續(xù) 3周，于第 2次注射硝酸甘油后給予散偏湯顆粒劑9.1 g/（kg·d）（分別按成人每天生藥量91 g算，大鼠用藥量按成人藥量6倍算，大鼠每日灌胃體積為10 mL/kg，藥液濃度為0.91 g/mL），散偏湯顆粒劑灌胃，共1周，普通飼養(yǎng)。最后1次硝酸甘油造模2 h后，給予2%戊巴比妥鈉液腹腔注射麻醉（麻醉劑量：40 mg/kg），提取標(biāo)本，斷頭取腦，在干冰保護(hù)下快速將大鼠中腦及三叉神經(jīng)節(jié)剝離，放置-70℃冰箱中備用。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 一般情況觀察 觀察動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d內(nèi)的一般情況（包括精神、活動(dòng)、皮毛色澤、進(jìn)食、大便等情況）。觀察第3次注射硝酸甘油或0.9%氯化鈉注射液后的行為變化，記錄大鼠搔頭次數(shù)：以前肢搔臉1次計(jì)1次，后肢快速搔頭動(dòng)作從開(kāi)始到停止計(jì)1次，皮下注射硝酸甘油后至2 h的搔頭次數(shù)，以判斷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷?fù)制是否成功［5］。

1.5.2 Western blotting法測(cè)定三叉神經(jīng)節(jié)CGRP蛋白表達(dá)變化 準(zhǔn)備進(jìn)行SDS-PAGE，5%濃縮膠，12%分離膠，取經(jīng)樣品緩沖液變性處理后的待檢測(cè)組織蛋白樣品上樣，每孔20 μg。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜完成后經(jīng)麗春紅染色試劑對(duì)膜進(jìn)行染色并鑒定轉(zhuǎn)膜效果。將轉(zhuǎn)膜良好的膜完全浸沒(méi)于5%BSA-TBST中，室溫輕搖封閉30 min，用5%BSA-TBST稀釋一抗，稀釋比例CGRP兔多抗1∶1000，室溫振搖 10 min，充分混勻抗體，放 4℃搖床振搖過(guò)夜。第2日TBST洗膜5次，每次5 min，用5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG（H+L）HRP，1∶10000，室溫輕搖 40 min，TBST 洗膜 6 次，每次 5 min，ECL孵育，X光膠片曝光經(jīng)顯影，定影后，掃描ImageJ軟件處理圖片，TotalLab Quant讀取條帶IOD值。

1.5.3 Real time PCR檢測(cè)大鼠中腦CGRP基因表達(dá)變化 采用TRNzol法提取組織樣品總RNA，使用NanoDropTMND-2000測(cè)定RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄后，將96-PCR板置于Real time PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，CGRP上游引物CCTAGACCTGGGCACCCT，CGRP下游引物CTTCT GGGAAATGACACTGGA。按以下程序進(jìn)行：95 ℃，30 s；40 個(gè) PCR 循環(huán)［95℃，5 s；60℃，40 s（收集熒光）］。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按（95 ℃，10 s；60℃，60 s；95 ℃，15 s）；并從 60 ℃緩慢加熱到99℃（儀器自動(dòng)進(jìn)行-Ramp Rate為0.05 ℃/s）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，首先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)，以（±s）表示，各組間進(jìn)行單因素方差分析，并行LDS檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布和方差不齊性，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況觀察

見(jiàn)表1。適應(yīng)性喂養(yǎng)期間各組大鼠一般情況良好，精神、毛發(fā)、食欲及大便正常。第3次注射硝酸甘油后大鼠行為學(xué)變化明顯，模型組與生理鹽水組搔頭次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠2 h內(nèi)行為學(xué)變化比較（次，±s）

表1 各組大鼠2 h內(nèi)行為學(xué)變化比較（次，±s）

與偏頭痛模型組比較，*P＜0.05。下同

組 別 n 搔頭次數(shù)偏頭痛模型組 6生理鹽水組 6琥珀酸舒馬普坦組 6 75.00±5.55 15.17±1.17*52.33±5.32*散偏湯組 657.17±1.94*

2.2 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中CGRP、PENK蛋白表達(dá)比較

見(jiàn)表2，圖1。偏頭痛模型組三叉神經(jīng)節(jié)CGRP蛋白表達(dá)較生理鹽水組顯著升高（P＜0.05）；散偏湯和琥珀酸舒馬普坦干預(yù)后，CGRP含量降低，與偏頭痛模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；散偏湯和琥珀酸舒馬普坦組干預(yù)后CGRP蛋白表達(dá)與生理鹽水組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。偏頭痛模型組三叉神經(jīng)節(jié)PENK蛋白表達(dá)較生理鹽水組降低（P＜0.05），散偏湯組和琥珀酸舒馬普坦組干預(yù)后PENK蛋白表達(dá)升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組三叉神經(jīng)節(jié)中 CGRP、PENK表達(dá)比較（±s）

表2 各組三叉神經(jīng)節(jié)中 CGRP、PENK表達(dá)比較（±s）

組 別 n CGRP PENK偏頭痛模型組 6生理鹽水組 6琥珀酸舒馬普坦組 6 69397.00±16227.65 59133.50±19548.17 20334.00±26475.41*76597.17±15117.16*40124.60±24243.19*76507.67±10413.65*散偏湯組 640144.67±22944.31*76402.00±4921.75*

圖1 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中CGRP、PENK蛋白表達(dá)

2.3 各組大鼠中腦CGRP、PENK基因表達(dá)比較 見(jiàn)表3。偏頭痛模型組大鼠中腦CGRP基因表達(dá)較生理鹽水組升高（P＜0.05）；散偏湯和琥珀酸舒馬普坦干預(yù)后，CGRP基因表達(dá)減少，與偏頭痛模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與生理鹽水組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），散偏湯與琥珀酸舒馬普坦組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；偏頭痛模型組中腦PENK蛋白表達(dá)較生理鹽水組降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），散偏湯組和琥珀酸舒馬普坦組中腦PENK基因表達(dá)與模型組比較升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與生理鹽水組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠中腦CGRP、PENK表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠中腦CGRP、PENK表達(dá)比較（±s）

組 別 n CGRP PENK偏頭痛模型組 6生理鹽水組 6琥珀酸舒馬普坦組 6 2.80±2.38 0.77±0.19 0.93±0.29* 0.83±0.17 0.66±1.98* 0.87±0.21散偏湯組 60.66±0.21* 0.91±0.19

3 討 論

散偏湯記載于清·陳士鐸《辨證錄·卷二》，主治半邊頭風(fēng)。陳士鐸認(rèn)為“此病得之郁氣不宣，又加風(fēng)邪襲之于少陽(yáng)之經(jīng)”。故應(yīng)用散偏湯祛風(fēng)疏肝，通絡(luò)止痛，方藥白芍、川芎、郁李仁、柴胡、白芥子、香附、甘草、白芷組成。散偏湯中川芎為君藥，辛香善升，祛風(fēng)止痛作用，為治頭痛要藥；白芷祛風(fēng)解表，燥濕通竅，消痰，助川芎散頭風(fēng)；白芥子通竅蠲痰，引藥入深，直達(dá)病所；柴胡、香附升清舉陽(yáng)、疏肝達(dá)郁。現(xiàn)代醫(yī)家常用散偏湯治療偏頭痛，其臨床療效顯著［6］，但其作用機(jī)制尚不完全明確。

CGRP是一種神經(jīng)肽，廣泛存在于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的感覺(jué)神經(jīng)元胞體和末梢，通過(guò)外周炎癥和中樞調(diào)節(jié)來(lái)提高偏頭痛患者的神經(jīng)傳遞［7-8］。CGRP在外周由背根神經(jīng)節(jié)合成，在中樞由三叉神經(jīng)節(jié)合成，偏頭痛發(fā)作時(shí)，血管周圍神經(jīng)末梢和三叉神經(jīng)節(jié)釋放CGRP到頸內(nèi)外靜脈，外周血中CGRP濃度升高，CGRP作用于血管平滑肌引起血管擴(kuò)張，外周血管擴(kuò)張引起硬腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放許多神經(jīng)活性及血管活性物質(zhì)，如TNF-α、5-HT、組胺、緩激肽等引起神經(jīng)源性炎癥，這些致炎因子又可刺激CGRP的持續(xù)釋放。CGRP同時(shí)通過(guò)軸突反射將外周組織的局部感覺(jué)傳到中樞，CGRP在偏頭痛的發(fā)病過(guò)程除了發(fā)揮疼痛遞質(zhì)外還通過(guò)AMPA（AMPA）型谷氨酸受體導(dǎo)致疼痛致敏，放大痛覺(jué)信號(hào)?？傊?，在偏頭痛的發(fā)病過(guò)程中，CGRP在多個(gè)階段發(fā)揮廣泛且重要的作用，是偏頭痛發(fā)生的分子生物學(xué)特征之一，為CGRP受體拮抗劑治療偏頭痛的理論基礎(chǔ)［8］。也是偏頭痛研究領(lǐng)域不可忽視的重要理論之一。

內(nèi)啡肽（EOPS）是在體內(nèi)發(fā)揮嗎啡樣效應(yīng)的神經(jīng)肽，是神經(jīng)肽中與疼痛關(guān)系比較密切的一類物質(zhì)，在腦內(nèi)和脊髓中有明顯的鎮(zhèn)痛作用，腦啡肽（ENK）是內(nèi)啡肽的一種，PENK是ENK系統(tǒng)的前體（包括甲硫氨酸-腦啡肽、亮氨酸-腦啡肽、甲七肽和甲八肽等）。內(nèi)啡肽系統(tǒng)在外周主要是通過(guò)抑制神經(jīng)元興奮，延緩?fù)从X(jué)信號(hào)的擴(kuò)散和傳遞，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用；在中樞主要是影響中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、延髓腹內(nèi)側(cè)核等內(nèi)源性痛覺(jué)調(diào)制系統(tǒng)內(nèi)的脊髓投射神經(jīng)元的活化，激活痛覺(jué)下行抑制系統(tǒng)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，研究?jī)?nèi)啡肽系統(tǒng)在腦內(nèi)的鎮(zhèn)痛作用在偏頭痛治療的研究中有著重要意義。

我國(guó)文獻(xiàn)在殷商甲骨文就有“疾首”的交記載，《內(nèi)經(jīng)》稱本病為“腦風(fēng)”“首風(fēng)”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦為清陽(yáng)之府，易受風(fēng)邪，風(fēng)邪上擾，津液氣血運(yùn)行失常，津聚成痰，氣血瘀滯，痰瘀阻竅，腦失清靈不通則痛。散偏湯作為中藥治療偏頭痛，組方治法治則對(duì)偏頭痛發(fā)病的病因病機(jī)有針對(duì)性，且無(wú)藥物依賴、成癮及藥物過(guò)量性頭痛出現(xiàn)的危險(xiǎn)，同時(shí)現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)散偏湯中的川芎、白芷、白芍、白芥子、香附均有不同程度的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用［10-15］。在本實(shí)驗(yàn)研究中觀察到散偏湯組大鼠在注射硝酸甘油后煩躁、搔頭的表現(xiàn)較偏頭痛模型組明顯減少，以安靜蜷臥為主，其后間斷活動(dòng)，說(shuō)明散偏湯能夠改善偏頭痛動(dòng)物模型的行為學(xué)癥狀，有一定的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用。研究中觀察到中腦及三叉神經(jīng)節(jié)CGRP基因及蛋白表達(dá)下降，三叉神經(jīng)節(jié)中PENK蛋白表達(dá)升高，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)大鼠中腦中PENK表達(dá)下降，但經(jīng)散偏湯和琥珀酸舒馬普坦干預(yù)后較偏頭痛模型組有所升高，考慮散偏湯能夠減少CGRP在中腦和三叉神經(jīng)節(jié)的表達(dá)，提高鎮(zhèn)痛物質(zhì)PENK在中腦和三叉神經(jīng)節(jié)的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中散偏湯和舒馬普坦能夠改善硝酸甘油造成偏頭痛大鼠的病理狀態(tài)，能夠抑制CGRP介導(dǎo)疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)，改善內(nèi)啡肽系統(tǒng)中樞鎮(zhèn)痛作用，對(duì)散偏湯治療偏頭痛提供了客觀的物質(zhì)基礎(chǔ)，可能為散偏湯鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛的機(jī)制之一。課題組將進(jìn)一步研究散偏湯在偏頭痛作用的靶點(diǎn)和機(jī)制，為臨床治療提供依據(jù)。