王傳思 謝貽祥 姚 磊 黃鴻武 王永森 吳永軍

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院，安徽 六安 237005）

創(chuàng)面修復(fù)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，血管生成是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)，血管內(nèi)皮細(xì)胞和微血管數(shù)目是目前所知評價血管生成的主要指標(biāo)，臨床和動物實(shí)驗觀察發(fā)現(xiàn)參黃合劑促進(jìn)肛周創(chuàng)面組織修復(fù)及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)［1-5］，但作用機(jī)理不明。筆者通過建立大鼠體表瘺管模型，觀察參黃合劑對瘺管組織中微血管及血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 清潔級SD成熟雄性大鼠180只，2月齡，體質(zhì)量（200±30）g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中，許可證號為SCXK（皖）2014-0005。每籠飼養(yǎng)5只，自由飲水和攝食，清潔級管理。

1.2 試藥與儀器 1）藥物。參黃合劑（苦參、黃柏、孩兒茶、五倍子、烏頭、樟腦、冰片、制乳沒）按 20∶20∶10∶5∶10∶10∶15∶15 質(zhì)量比混合， 量取混合生藥 180 g， 加水500 mL，煎 0.5 h（烏頭先煎，樟腦、冰片后下），過濾濃縮至1.0 g/mL的生藥煎劑（六安市人民醫(yī)院中藥房提供并制備），4℃保存，給藥前復(fù)溫。0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20113297），高錳酸鉀外用片（濟(jì)南康福生制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H37022233）提供。2）試劑。UNEL試劑盒（批號20100902，上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司），抗α-SMA單抗、抗鼠IgG2a-過氧化物酶、蘇木精、伊紅（批號：20090605上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司），DAB顯示液 （批號：20120734，武漢博士德生物工程有限公司）。3）儀器。MV2CP410攝像機(jī)、IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)、CCD攝像機(jī)、100倍光學(xué)顯微鏡、Nikon 80i熒光顯微鏡（新飛達(dá)光學(xué)儀器公司）。

1.3 分組與造模 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：空白對照組，空白模型組，模型對照組，生理鹽水組，高錳酸鉀組，參黃合劑組各30只，按文獻(xiàn)［6］方法彈簧紗條埋置于SD大鼠頸背部并加混合菌液（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，批號：ATCC25922，由六安市人民醫(yī)院檢驗中心提供，1×1010CUF／L）種植污染法，制成體表瘺管模型。20 d后拆除大鼠頸背部彈簧紗條，見瘺口有膿性分泌物者為造模成功，所有均顯示造模成功

1.4 干預(yù)方法 空白對照組不作任何處理，空白模型組僅作造瘺不做瘺管切開掛線術(shù)，模型對照組僅作瘺管切開掛線術(shù)，正常喂養(yǎng)，不用任何藥物處理。生理鹽水組、高錳酸鉀組、參黃合劑組于術(shù)后第1日開始，每日上午、下午各1次，生理鹽水紗條，高錳酸鉀（1∶5000）水紗條，參黃合劑紗條分別濕敷創(chuàng)面30 min，總療程14 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）標(biāo)本采集：第1、7、14日從每組中隨機(jī)捉拿10只大鼠，其中5只立即腹腔注射水合氯醛法麻醉，拉脫頸椎法處死，取創(chuàng)面修復(fù)部位約0.5 cm×0.5 cm大小肉芽組織，稱重待測，另5只作創(chuàng)面肉芽組織的分離、培養(yǎng)。2）微血管數(shù)目的檢測：取1 g創(chuàng)面肉芽組織，常規(guī)固定、石蠟切片、HE染色，在普通光鏡下觀察創(chuàng)面肉芽組織形態(tài)學(xué)改變情況并攝片。100倍光學(xué)顯微鏡下在肉芽組織區(qū)域內(nèi)隨機(jī)法選取3個視野，進(jìn)行檢測，測算3個視野內(nèi)微血管數(shù)目的均值，計算得出數(shù)微血管的數(shù)目（MVC）。3）VEGF表達(dá)量測定：創(chuàng)面肉芽組織切片在室溫下與抗α-SMA單抗對切片孵育30 min后，再與抗鼠IgG2a-過氧化物酶結(jié)合物反應(yīng)，用DAB顯色、蘇木精、伊紅復(fù)染。采用圖像分析系統(tǒng)，采集數(shù)字圖像，在100倍光學(xué)顯微鏡下，應(yīng)用計算機(jī)系統(tǒng)得到比例因子，選擇藍(lán)色陰性區(qū)域，紅色陽性區(qū)域，測定陽性區(qū)域面積和光密度值，隨機(jī)選取每張切片內(nèi)3個視野，計算出平均值，測定VEGF表達(dá)情況，了解VEGF被激活的情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，每組自身比較t檢驗，組間用單因素方差分析，計數(shù)資料χ2檢驗，療效比較Ridit分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組肉芽組織微血管數(shù)目檢測 見圖1，表1。普通光鏡下觀察空白對照組無明顯變化，余5組標(biāo)本均可見大量實(shí)性細(xì)胞索，由內(nèi)皮細(xì)胞增生形成，毛細(xì)血管呈擴(kuò)張狀態(tài)，垂直向創(chuàng)面生長，彎曲的毛細(xì)血管網(wǎng)以小動脈為軸心，以袢狀在周圍形成。有大量新生的成纖維細(xì)胞在毛細(xì)血管周圍，可見許多炎性細(xì)胞浸潤。100倍光學(xué)顯微鏡下在新生的成纖維細(xì)胞內(nèi)可見新生血管及微血管生成，早期成散在分布，后期逐步排列，部分血管內(nèi)可見血栓。術(shù)后1 d各組之間未見明顯區(qū)別，術(shù)后7 d起增多達(dá)高峰，術(shù)后14 d明顯減少，僅見散在分布?？瞻啄Ｐ徒M、模型對照組、生理鹽水組之間比較未見明顯區(qū)別，高錳酸鉀組及參黃合劑組與空白模型組，模型對照組，生理鹽水組比較增加較明顯，參黃合劑組增長最明顯，術(shù)后1 d每組均可見大量滲出液及炎性細(xì)胞，術(shù)后7 d均下降明顯，術(shù)后14 d可見少量，每組之間差別不明顯。

圖1 各組肉芽組織鏡下圖像（HE染色，100倍）

表1 各組大鼠瘺管肉芽組織微血管計數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠瘺管肉芽組織微血管計數(shù)比較（±s）

與空白對照組、空白模型組、模型對照組、生理鹽水組比較，*P＜0.05；與高錳酸鉀組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n 術(shù)后14 d空白對照組 30 12.74±1.14空白模型組 30 22.18±1.18模型對照組 30 26.29±1.64 13.61±1.52 37.44±2.07高錳酸鉀組 30 16.83±1.30* 50.37±3.44* 19.60±2.41*參黃合劑組 30 17.61±1.14* 67.68±4.22*△ 21.63±1.48*△術(shù)后1 d 術(shù)后7 d 13.66±1.22 12.84±2.19 12.82±1.24 32.46±2.13 12.20±1.48 35.47±2.41生理鹽水組 30 26.45±1.95

2.2 各組創(chuàng)面肉芽組織中VEGF表達(dá)比較 見圖2、表2。100倍光學(xué)顯微鏡下陽性區(qū)域呈棕黃色或棕褐色，測定陽性區(qū)域面積、陽性比率和光密度值，結(jié)果顯示術(shù)后1 d各組之間未見明顯區(qū)別，術(shù)后7 d空白模型組，模型對照組、生理鹽水組之間比較未見明顯區(qū)別，高錳酸鉀組及參黃合劑組與空白模型組、模型對照組、生理鹽水組比較增加較明顯，參黃合劑組增長最明顯，提示隨術(shù)后創(chuàng)面恢復(fù)時間的增加呈遞增趨勢，且在參黃合劑組中表達(dá)明顯高于生理鹽水及高錳酸鉀組（P＜0.05）。術(shù)后14 d明顯下降，各組之間已無明顯差別（P>0.05）。

圖2 各組創(chuàng)面肉芽組織中VEGF的表達(dá)變化（IHC-P染色，100倍）

表2 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中VEGF表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中VEGF表達(dá)比較（±s）

組 別 n 術(shù)后14 d空白對照組 30 0.12±0.06空白模型組 30 0.18±0.04模型對照組 30 0.22±0.04術(shù)后1 d 術(shù)后7 d 0.10±0.02 0.09±0.04 0.22±0.03 0.26±0.01 0.20±0.01 0.21±0.03生理鹽水組 30 0.21±0.03*0.27±0.03 0.44±0.03*高錳酸鉀組 30 0.31±0.02* 0.56±0.02* 0.23±0.06*參黃合劑組 30 0.34±0.02* 0.70±0.03*△ 0.25±0.05*△

3 討 論

在我國肛門直腸類疾病中，肛瘺發(fā)病率達(dá)1.67%～3.60%，由于肛瘺創(chuàng)面所處位置的關(guān)系，保守治療效果不佳，手術(shù)仍是目前較主要的治療方法，加之開放性創(chuàng)面，修復(fù)緩慢［7］。創(chuàng)面修復(fù)雖是多種細(xì)胞因子參與調(diào)控的復(fù)雜的細(xì)胞活動，但發(fā)揮了十分重要作用的VEGF是激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的首要步驟。VEGF是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，具有高度特異性，能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞生成微血管，從而促進(jìn)血管生成［8］。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多促血管生成因子，在已發(fā)現(xiàn)的促血管生成因子中，VEGF在生理性及病理性血管新生過程中的作用尤為重要［9］。VEGF又稱為血管滲透性因子，是一種分子量為39 kD的分泌性糖蛋白，能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，增加微血管的通透性，改變細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)內(nèi)皮遷移等［10］。在很多正常動物和人的成熟器官中VEGF低水平表達(dá)，較高水平表達(dá)于創(chuàng)面血管生成，或部分組織器官發(fā)育過程中［11］。VEGF主要維持血管密度和通透性，參與血管再生如細(xì)胞基質(zhì)降解、增殖內(nèi)皮細(xì)胞、分化與吻合毛細(xì)血管等過程［12］；VEGF主要由漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌，結(jié)合受體含激酶插入功能區(qū)受體（KDR）結(jié)合fms樣酪氨酸激酶（KDR/Flk-1），磷酸化受體蛋白酪氨酸殘基，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖；而肉芽組織的基質(zhì)和毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)形成，主要由纖維蛋白原和血漿蛋白，作用于細(xì)胞基質(zhì)形成纖維凝膠［13］。VEGF能使各種蛋白分解酶等釋放，毛細(xì)血管基底膜降解，微血管內(nèi)皮細(xì)胞集聚，形成膠原凝膠，生成肉芽組織［14］。VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞表面的胞外區(qū)結(jié)合后，進(jìn)一步酪氨酸激酶讓磷酸化，其相應(yīng)下游蛋白被激活，起到分裂、增殖和遷移內(nèi)皮細(xì)胞，新生細(xì)胞的凋亡受到阻止，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)［15］。

我們通過肛瘺術(shù)后的中醫(yī)系統(tǒng)辨證分析，確立證型為“濕熱內(nèi)蘊(yùn)，經(jīng)絡(luò)瘀阻”，擬定“清熱祛濕、活血消腫”治療大法，命名參黃合劑方名和藥物組成。我們已經(jīng)完成的臨床及實(shí)驗研究結(jié)果表明參黃合劑在肛周相關(guān)疾病術(shù)后應(yīng)用中，效果顯著，能促進(jìn)炎癥消退，減輕術(shù)后腫痛，通過基因水平調(diào)節(jié)創(chuàng)面VEGF的表達(dá)，促進(jìn)組織修復(fù)，使術(shù)后創(chuàng)面愈合時間縮短，效果顯著［1-5］。因此及時將中藥參黃合劑應(yīng)用在肛腸類疾病術(shù)后的愈合過程中，能夠更好地發(fā)揮中醫(yī)中藥的傳統(tǒng)優(yōu)勢，在臨床治療方面更為顯著。盡管現(xiàn)在該領(lǐng)域研究較多，但都停留在臨床觀察階段，沒有對調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入系統(tǒng)研究，這就明顯制約了中醫(yī)中藥在這一領(lǐng)域里的廣泛應(yīng)用。

本次實(shí)驗創(chuàng)新地建立瘺管術(shù)后的動物模型，并將參黃合劑應(yīng)用于術(shù)后創(chuàng)面，在創(chuàng)面修復(fù)的不同時期，參黃合劑組創(chuàng)面局部微血管生成明顯高于高錳酸鉀組、生理鹽水組及空白模型組，參黃合劑組VEGF激活表達(dá)亦呈現(xiàn)出同樣的趨勢，創(chuàng)面新生血管生成速度明顯增加，創(chuàng)面的愈合速度明顯加快，創(chuàng)面愈合質(zhì)量顯著提高，較好地調(diào)節(jié)了創(chuàng)面修復(fù)過程中VEGF的表達(dá)；對照組高錳酸鉀利用溫?zé)嵝?yīng)，促進(jìn)局部組織血液循環(huán)，解除微小血管痙攣收縮，并具有消炎止痛的功效。而中藥參黃合劑作用機(jī)制廣泛而復(fù)雜，另一方面，傳統(tǒng)熏洗療法使藥物直達(dá)病所，溫?zé)釘U(kuò)張創(chuàng)面的微血管，加快局部血液循環(huán)，促進(jìn)回流，對白細(xì)胞釋放蛋白溶解酶起增強(qiáng)作用，創(chuàng)面壞死組織得以快速清除。溫?zé)嵝?yīng)起鎮(zhèn)痛作用，使肛周肌肉松弛，水腫減輕止痛，減少出血，促進(jìn)組織修復(fù)，使術(shù)后創(chuàng)面愈合時間明顯縮短。

本次實(shí)驗表明，參黃合劑對大鼠體表瘺管術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)過程中的血管生成具有明顯的促進(jìn)作用，且優(yōu)于高錳酸鉀，參黃合劑明顯促進(jìn)了創(chuàng)面肉芽組織中VEGF的激活，從而調(diào)節(jié)了創(chuàng)面肉芽組織中微血管及血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成。他人的研究成就以及我們以往的工作積累啟發(fā)我們得出這樣的結(jié)論：傳統(tǒng)中醫(yī)中藥應(yīng)用于瘺管術(shù)后開放性創(chuàng)面，可以提高創(chuàng)面的血管生成，并且這種對創(chuàng)面細(xì)胞和分子調(diào)控功能的實(shí)現(xiàn)是從調(diào)控VEGF激活開始，進(jìn)而逐步分層實(shí)現(xiàn)的。

但是中藥參黃合劑對體表瘺管術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)的影響是多系統(tǒng)多途徑的，是各種因素綜合作用的結(jié)果，其他方面的研究，還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。