姜志遠(yuǎn),劉世萍,馬妍妍,李業(yè)雨
(1.黑龍江省農(nóng)墾總局疾病預(yù)防控制中心,黑龍江 哈爾濱 150090;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部,黑龍江 哈爾濱 150001)
穿心蓮分散片是由穿心蓮藥材經(jīng)提取物后,加入適當(dāng)?shù)妮o料制備的速釋片劑,具有清熱解毒、涼血消腫的藥理作用,在臨床上廣泛地應(yīng)用于邪毒內(nèi)盛,感冒發(fā)熱,咽喉腫痛,口舌生瘡。穿心蓮分散片的藥效成分有穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等二萜類內(nèi)酯化合物。目前穿心蓮分散片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只設(shè)定穿心蓮內(nèi)酯的含量限值,無法滿足穿心蓮分散片的質(zhì)量控制要求。由于片劑的多指標(biāo)成分質(zhì)量評價(jià)及控制需要大量的化學(xué)對照品,同時(shí)二萜類內(nèi)酯對照品的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、不易制得、價(jià)格昂貴等原因,因此對穿心蓮分散片的多指標(biāo)成分質(zhì)量評價(jià),在實(shí)際生產(chǎn)中很難推廣。本實(shí)驗(yàn)以含量較高、性質(zhì)穩(wěn)定的穿心蓮內(nèi)酯為參照物, 建立穿心蓮分散片4種內(nèi)酯類成分同步測定的一測多評法, 實(shí)現(xiàn)降低檢測成本, 提高含量檢測的質(zhì)量和效率的目的,為穿心蓮分散片的多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)及控制提供理論依據(jù)和參考方法。
穿心蓮分散片(黑龍江烏蘇里江制藥有限公司哈爾濱分公司提供,規(guī)格:0.55 g/片,批號為20170301、20170302、20170303、20170304、20170401、20170402)。對照品穿心蓮內(nèi)酯(批號:110797-201609)、脫水穿心蓮內(nèi)酯(批號:110854-201710)購于中國食品藥品檢定研究院。新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯對照品購于上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心(經(jīng)HPLC檢測,面積歸一化法計(jì)算,純度>98%)。色譜純乙腈(Merck公司生產(chǎn)),實(shí)驗(yàn)用水為自制的超純水,其他的檢測試劑均為分析純。
Agilent 1100 型高效液相色譜儀,配有四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器;SHIMADZU LC-2010AHT型液相色譜儀(日本島津制作所);Phemomenex C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱、Luna C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱、YMC-Pack C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;BS210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司);KQ-600型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FiveEasy Plus型pH計(jì)(METTLER TOLEDO公司);Milli-Q A10型超純水系統(tǒng)(默克密理博公司)。
2.1.1 色譜條件
色譜柱:PhemomenexC18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水,梯度洗脫:0~52 min,20%~40%乙腈;52~65 min,40%~80%乙腈;流速1.2 mL/min;柱溫25℃;檢測波長205 nm;進(jìn)樣量10 μL。內(nèi)酯混合對照品和穿心蓮分散片的HPLC圖見圖1。
圖1 內(nèi)酯混合對照品(A)和穿心蓮分散片樣品(B)HPLC圖
2.1.2 對照品溶液的制備
精密稱取穿心蓮的4種內(nèi)酯對照品適量,加入甲醇配制成每1 mL中含穿心蓮內(nèi)酯0.042 1 mg,新穿心蓮內(nèi)酯0.054 6 mg,去氧穿心蓮內(nèi)酯0.053 8 mg,脫水穿心蓮內(nèi)酯0.082 2 mg的混合溶液,即得。
2.1.3 供試品溶液的制備
取穿心蓮分散片10片,除去包衣,研細(xì),取約0.4 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,密塞,稱定重量,振搖使其分散均勻,室溫下浸泡1 h,置數(shù)控超聲波清洗器內(nèi)超聲處理30 min,放冷,再次稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,振搖使其混合均勻,0.22 μm微孔濾膜濾過,精密量取續(xù)濾液10 mL,置中性氧化鋁柱(200~300目,5 g,柱內(nèi)徑為1.5 cm)上,用甲醇20 mL洗脫,收集洗脫液,置50 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.1.4 內(nèi)酯成分的線性關(guān)系考察
取2.1.2項(xiàng)下的穿心蓮內(nèi)酯混合對照品溶液,按2.1.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、12、15、20 μL,測定內(nèi)酯的峰面積。以內(nèi)酯的峰面積(A)對進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。
表1 穿心蓮分散片中4種內(nèi)酯成分的線性關(guān)系
2.1.5 精密度試驗(yàn)
取2.1.2項(xiàng)下的穿心蓮內(nèi)酯混合對照品溶液,按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣10 μL,記錄內(nèi)酯成分的峰面積。結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等4種成分峰面積的RSD值分別為0.27%,0.34%,0.65%,0.41%,表明儀器精密度良好。
2.1.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)
取穿心蓮分散片(批號:20170301),按2.1.3項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液,室溫放置,在0、2、4、8、12、16、24 h分別進(jìn)樣10 μL,記錄4種內(nèi)酯類成分的峰面積,結(jié)果表明,穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等4種成分峰面積的RSD值分別為0.37%, 0.52%,0.78%,0.42%, 說明穿心蓮分散片的供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)
取穿心蓮分散片(批號:20170301),按2.1.3項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液,平行配制6份,按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄4種內(nèi)酯類成分的峰面積。通過計(jì)算得到,穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等4種內(nèi)酯成分的含量分別為19.56,15.93, 22.27和21.42 mg/g,RSD值分別為0.35%,0.51%,0.86%和0.44%,說明設(shè)定的提取方法和檢測方法的重復(fù)性良好。
2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)
取已知含量的穿心蓮分散片(批號:20170301)細(xì)粉0.2 g,精密加入等量的內(nèi)酯混合對照品, 按2.1.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液, 依法測定4種內(nèi)酯成分的含量并計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果表明,穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等4種成分的平均加樣回收率分別為99.07%,98.29%,96.73%,99.24%;RSD值分別為0.36%,0.42%,0.83%,0.75%,說明設(shè)定的提取方法和檢測方法的準(zhǔn)確度良好。
取2.1.2項(xiàng)下的穿心蓮內(nèi)酯混合對照品溶液,按2.1.1項(xiàng)下的色譜條件精密進(jìn)樣2、5、10、15、20 μL,測定4種內(nèi)酯類成分的峰面積。然后以穿心蓮內(nèi)酯為參照物, 根據(jù)公式Fr= (An×Ws) / (As×Wn)分別計(jì)算新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等3種待測成分的相對校正因子,式中Fr、An、Ws、As、Wn分別為相對校正因子、參照成分的峰面積及其質(zhì)量濃度(mg/mL)、待測成分的峰面積及其質(zhì)量濃度(mg/mL)。結(jié)果見表2。
表2 穿心蓮分散片中3種待測皂苷類成分的相對校正因子
2.3.1 不同的檢測儀器對相對校正因子的影響
考察不同品牌的2種色譜儀及3種色譜柱(規(guī)格均為:250 mm×4.6 mm,5 μm)對穿心蓮分散片的4種內(nèi)酯類成分相對校正因子的影響, 結(jié)果相對校正因子的RSD<2%, 表明使用不同品牌的檢測儀器及色譜柱均具有良好的重現(xiàn)性。結(jié)果見表3。
2.3.2 待測成分色譜峰的定位
以穿心蓮內(nèi)酯的保留時(shí)間為定位標(biāo)準(zhǔn), 計(jì)算新穿心蓮內(nèi)酯等3種待測成分在不同品牌色譜儀及色譜柱的相對保留時(shí)間。結(jié)果相對保留時(shí)間的RSD<2%, 說明在不同色譜儀和色譜柱下,相對保留時(shí)間的變化值較小, 重現(xiàn)性良好。結(jié)果見表4。
按設(shè)定的含量測定方法,用一測多評法(QAMS)與外標(biāo)法(ESM)同時(shí)測定6批穿心蓮分散片樣品中穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯等4種成分的含量。結(jié)果表明,QAMS法測得的含量數(shù)據(jù)與ESM法測得的結(jié)果無顯著差異(RSD<2%)。檢測結(jié)果見表5。
表3 不同的液相色譜儀及色譜柱測得的相對校正因子
表4 不同的液相色譜儀及色譜柱測得的相對保留時(shí)間
表5 穿心蓮分散片中4種內(nèi)酯成分的含量測定比較結(jié)果表(mg/mL)
穿心蓮分散片的化學(xué)成分比較單一,主要為二萜內(nèi)酯類的4種成分。這些成分在同一色譜系統(tǒng)中的出峰時(shí)間及峰形等也會(huì)受到色譜柱、溶劑、柱溫等諸多因素的影響,因此,待測成分色譜峰的定位非常重要,關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。本實(shí)驗(yàn)采用穿心蓮內(nèi)酯的保留時(shí)間作為待測成分的定位標(biāo)準(zhǔn),穿心蓮內(nèi)酯類成分的相對保留時(shí)間在不同的檢測儀器及色譜柱條件下重現(xiàn)性較好(RSD值<2.0% )。
通過方法學(xué)研究,不同品牌的2種色譜儀及3種色譜柱對穿心蓮分散片內(nèi)酯類成分的相對校正因子和相對保留時(shí)間影響較小 (RSD<2%)。6批穿心蓮分散片樣品的含量測定結(jié)果表明: QAMS法測得的含量數(shù)據(jù)與ESM法測得的結(jié)果無顯著差異,說明建立的QAMS法可對穿心蓮分散片的4種內(nèi)酯類成分的含量可以實(shí)現(xiàn)同步測定, 為穿心蓮分散片的多指標(biāo)質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)和參考方法。