樊曉明，翟宇，安霞，吳紅彥,李海龍*

(1.甘肅省定西市中醫(yī)院藥劑科，甘肅 定西 743000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院臨檢基礎(chǔ)教研室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室 甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，也是癌癥死因中排第二位的惡性腫瘤[1]。我國(guó)腫瘤統(tǒng)計(jì)資料顯示[2]：全國(guó)惡性腫瘤發(fā)病數(shù)據(jù)中，城市地區(qū)惡性腫瘤新發(fā)病胃癌排第3位，農(nóng)村腫瘤登記發(fā)病胃癌排第2位，全國(guó)惡性腫瘤死亡胃癌排第3位，防控形勢(shì)嚴(yán)峻。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是腫瘤復(fù)發(fā)、治愈率低的重要原因。中醫(yī)藥防治腫瘤的優(yōu)勢(shì)十分明顯，在抑制腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面具有一定的臨床應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值，然而相關(guān)機(jī)制并未闡明。本課題組前期研究顯示：當(dāng)歸貝母苦參丸干預(yù)胃癌和肝癌的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示有明確的藥效。另外，加味當(dāng)歸貝母苦參丸對(duì)MFC胃癌荷瘤小鼠具有顯著抑瘤作用，而且可以下調(diào)荷瘤小鼠腫瘤組織中的TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和My D88 mRNA和蛋白的表達(dá)[3]。當(dāng)歸貝母苦參丸含藥血清可以抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[4]，而其機(jī)制并未闡明。另外，當(dāng)歸貝母苦參丸加味方可以下調(diào)H22肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織中MMP13和bFGF mRNA和蛋白的表達(dá)[5]，進(jìn)而抑制腫瘤侵襲和血管生成。為明確當(dāng)歸貝母苦參丸加味方對(duì)胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織是否也有相同的作用，本研究擬通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及免疫組化法檢測(cè)荷瘤小鼠胃癌組織中腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物VEGFA、MMP13、TGF-β mRNA和蛋白的表達(dá)變化，為中醫(yī)藥臨床防治胃癌提供有效的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c-nu小鼠60只，體質(zhì)量(20±2)g，雌、雄各半，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;合格證號(hào):SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)條件:室溫20～25℃，濕度45%～55%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲水自由，飼料由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，MFC前胃癌細(xì)胞購(gòu)自于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 儀器與試劑

生物安全柜(力康公司)；CO2培養(yǎng)箱(力康公司)；熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)；ABI7500熒光PCR儀(ABI，美國(guó)ABI公司)。DMEM培養(yǎng)基(健順生物科技有限公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DR036A，大連寶生物工程有限公司)，GoTaq?qPCR Master Mix擴(kuò)增試劑盒(A6010，promega公司)，一抗和二抗分別由博士德生物和中杉金橋公司提供。加味當(dāng)歸貝母苦參丸主要藥物由黃芪、當(dāng)歸、浙貝母、苦參、山慈菇等組成，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，順鉑注射液，20 mg/支，江蘇毫森藥業(yè)股份有限公司(批號(hào):H20010743)。

1.3 方法

1.3.1 荷瘤鼠模型的建立

將收集好的小鼠體內(nèi)傳代的細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整為15×106/mL的懸液，在小鼠腋下接種胃癌MFC細(xì)胞，每只接種量為0.2 mL。

1.3.2 治療及分組

造模后觀察腫瘤達(dá)到0.5 cm左右直徑時(shí)，剔除體積過大或過小的小鼠，將篩選合格的48只小鼠隨機(jī)分設(shè)為模型組、順鉑陽性對(duì)照組、加味當(dāng)歸貝母苦參丸高、低劑量組、順鉑聯(lián)合加味當(dāng)歸貝母苦參丸高、低劑量組共6個(gè)組。分組后第二天開始治療，模型組:每只小鼠予蒸餾水0.2 mL灌胃, 同時(shí)予理鹽水0.1 mL腹腔注射；中藥組予中藥水提物0.2 mL灌胃；聯(lián)合組予中藥和順鉑0.1 mL(劑量25 mg/kg)腹腔注射；順鉑組:予蒸餾水0.2 mL灌胃, 同時(shí)予順鉑0.1 mL(劑量25 mg/kg)腹腔注射隔日給藥。以上藥物順鉑5日給藥1次，共3次，當(dāng)歸貝母苦參丸加味方每日1次，共14 d。

1.3.3 RT-qPCR檢測(cè)VEGFA、MMP13和TGF-β mRNA的表達(dá)

將腫瘤組織從液氮中取出片刻后，用電子天平稱取30 mg置于經(jīng)DEPC處理的EP管中，加入Trizol試劑裂解液勻漿，常規(guī)低溫抽提總RNA后，用無RNA酶水溶解并檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。用Takara 036A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，提取完成后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。使用PREMEGO擴(kuò)增試劑GoTaq?qPCR Master Mix擴(kuò)增試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為:95℃5 min預(yù)變性，95℃ 10 s變性、60℃ 20 s退火40個(gè)循環(huán),而后分析溶解曲線，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，以β-actin作為內(nèi)參基因，相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采取2-△△CT法計(jì)算,獨(dú)立樣本重復(fù)3次檢測(cè), 小鼠VEGF、 MMP13、TGF-β基因的引物序列見表1。

表1 小鼠MMP13、VEGF、TGF-β和基因的擴(kuò)增引物序列

1.3.4 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)MMP13、VEGFA和TGF-β蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法采用ABC法。其簡(jiǎn)要過程如下:各組腫瘤組織樣本石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，以3%去離子水滅活內(nèi)源性酶10 min，微波修復(fù)抗原5 min，間隔重復(fù)1次；然后依次滴加一抗、生物素化山羊抗兔;滴加SABC，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度脫水透明后封片，顯微鏡下觀察、拍照。結(jié)果判定：以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)記錄各組樣本的VEGF、MMP13和TGF-β平均灰度，作為蛋白表達(dá)的量化指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR分別檢測(cè)VEGFA、MMP13和TGF-β mRNA的表達(dá)

各組RT-qPCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比，各干預(yù)組VEGFA、MMP13、TGF-β mRNA表達(dá)量均顯示有不同程度下調(diào)，其中中藥高劑量組，順鉑組以及中藥高劑量加順鉑組下調(diào)較為明顯。尤其以中藥高劑量加順鉑組用藥組下調(diào)表達(dá)較為顯著(P<0.05,見表2)。

2.2 免疫組化法分別檢測(cè)VEGFA、MMP13和TGF-β蛋白的表達(dá)

免疫組化法檢測(cè)各指標(biāo)，圖片顯示：胞漿或胞膜出現(xiàn)的黃色或棕黃色顆粒為陽性著色。各組蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,VEGFA、MMP13、TGF-β蛋白著色與模型組相比呈現(xiàn)深著色現(xiàn)象，表明為強(qiáng)陽性或陽性表達(dá)，而模型組呈現(xiàn)弱陽性或陰性表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。平均灰度分析可見，與模型組比較，各治療VEGFA、MMP13和TGF-β的表達(dá)均有下降，順鉑組VEGFA、MMP13、TGF-β的表達(dá)改變優(yōu)于中藥低劑量組、高劑量組；中藥高劑量加順鉑組、中藥低劑量加順鉑組VEGFA、MMP13、TGF-β的表達(dá)改變明顯優(yōu)于順鉑組、中藥高劑量、低劑量組。見表3，圖1～3。

表2 各組腫瘤VEGFA、MMP13和TGF-β的mRNA表達(dá)的比較

注:與模型組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.01；與中藥低劑量組比較，△△P<0.01;與順鉑組比較，▼P<0.05，▼▼P<0.01;與中藥高劑量組比較，※P<0.05，※※P<0.01

圖1 免疫組化染色檢測(cè)各組MMP13表達(dá)(免疫組化染色，×400)

圖2 免疫組化染色檢測(cè)各組VEGF表達(dá)(免疫組化染色，×400)

圖3 免疫組化染色檢測(cè)各組TGF-β表達(dá)(免疫組化染色，×400)

組別n MMP13VEGFATGF-β模型組571.43±4.5986.67±2.6597.34±3.77順鉑組599.53±2.12▲▲114.94±3.08▲▲119.53±1.47▲▲中藥低劑量組580.61±2.06▼▼95.61±3.12▲▼▼103.33±2.01▼▼中藥高劑量組587.45±1.65▲▲△△▼▼105.24±2.46▲▲△△▼▼114.86±1.97▲△△▼中藥低劑量加順鉑組5109.36±1.96▲▲△△▼▼※※119.29±1.12▲▲△△※※123.73±1.42▲▲△△▼※※中藥高劑量加順鉑組5115.71±2.25▲▲△△▼▼※※123.66±1.90▲▲△△▼※※127.92±1.84▲▲△△▼▼※※

注:與模型組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.01；與中藥低劑量組比較，△△P<0.01;與順鉑組比較，▼P<0.05，▼▼P<0.01;與中藥高劑量組比較，※P<0.05，※※P<0.01

3 討論

侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤的惡性表征之一，難以徹底治愈的重要原因。近年來，通過重要生物標(biāo)志物靶向治療是抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移研究的熱點(diǎn)之一。其中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)具有促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和血管形成的作用[6]，人基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP13)作為蛋白水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[7]，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)直接依賴于Smad,p38 MAPK, 和PI3K/Akt多個(gè)腫瘤抑制和腫瘤促進(jìn)作用侵襲轉(zhuǎn)移[8]。因此，VEGFA、MMP13、TGF-β均為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要腫瘤標(biāo)志物。黃鋼丁等[9]研究顯示，胃癌組織MMP-13蛋白表達(dá)率顯著高于癌旁組織，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無轉(zhuǎn)移組；胃癌組織MMP-13蛋白表達(dá)率增高與胃癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道,胃癌腫瘤組織中MMP-13的高表達(dá)與總生存期縮短呈顯著相關(guān)[10]。因此，MMP-13可作為判斷胃癌惡性程度和預(yù)測(cè)預(yù)后的參考指標(biāo)。

TGF-β的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)；TGF-β1陽性的患者比其陰性的患者更易發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]；研究報(bào)道,胃癌細(xì)胞中高表達(dá)的TGF-β1的可以誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞纖維化，伴有E-cadherin上調(diào)，αSMA下調(diào)[12]。TGF-β1受體阻滯劑SB-431542可以阻斷上述改變，部分減輕早期胃癌腹膜播散。TGF-β1誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，經(jīng)由fascin蛋白介導(dǎo)，包括ERK和JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也參與其中。

胃癌組織中VEGF的表達(dá)顯著高于正常胃黏膜組織；且癌組織中VEGF的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯和TNM分期均有顯著相關(guān)性[13-14]。對(duì)于接受根治性手術(shù)治療的Ⅰ～Ⅲ期胃癌患者,VEGF和HIF-1α陽性表達(dá)可能是影響胃癌患者的不良預(yù)后因素[15]。高表達(dá)VEGFA和VEGFC的胃癌組織，其腫瘤體積較大，淋巴管密度、微血管密度、淋巴管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度高于癌周組織[16]。而且，體外實(shí)驗(yàn)研究顯示，沉默VEGF-A基因的表達(dá)能顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖[16-17]；動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)顯示，沉默VEGFA基因能縮小腫瘤體積。研究報(bào)道[7]：沉默VEGFA 基因還可以下調(diào)荷瘤鼠腫瘤組織中SIRT1、Survivin和Bcl-2的表達(dá)，而上調(diào)p53和p21的表達(dá)。

本研究顯示：當(dāng)歸貝母苦參丸加味方可抑制腫瘤組織中VEGFA、MMP13和TGF-β mRNA RNA和蛋白的表達(dá), 并且在與化療藥物聯(lián)用后，VEGFA、MMP13和TGF-β mRNA和蛋白的下調(diào)表達(dá)更加明顯，加味當(dāng)歸貝母苦參丸可以調(diào)控VEGFA、MMP13和TGF-β的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用。

當(dāng)歸貝母苦參丸出自《金匱要略》，原用于治療妊娠小便困難，具有養(yǎng)血開郁清熱除濕的功效。加味當(dāng)歸貝母苦參丸在此基礎(chǔ)上加黃芪、全蝎、山慈菇等益氣解毒藥組成新方。新方具有益氣扶正，養(yǎng)血活血，化痰散結(jié)，清熱利濕，解毒散結(jié)，通絡(luò)止痛等功效，新方契合了腫瘤正氣不足，痰(濕)濁、癌毒、瘀血內(nèi)阻的發(fā)病機(jī)制。前期研究顯示，當(dāng)歸貝母苦參丸對(duì)消化道常見腫瘤胃癌和肝癌具有明確抑瘤作用和相應(yīng)機(jī)制[3-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，本研究中所用藥材含有效成分，如黃芪多糖、當(dāng)歸多糖、貝母堿、苦參堿等成份均對(duì)多種癌細(xì)胞有明顯的抑制作用，這些有效成分可能是抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。綜上所述，當(dāng)歸貝母苦參丸加味方發(fā)揮對(duì)荷瘤小鼠MFC胃癌的抗腫瘤作用與下調(diào)VEGFA、MMP13和TGF-βmRNA的表達(dá)和蛋白的表達(dá)有關(guān)。