傅思瑩，何玉萍，王南卜，謝宇暉

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占女性癌癥死亡的15%[1]，其發(fā)病是多因素、多基因、多階段共同參與的結(jié)果。近年來(lái)乳腺癌的發(fā)病率逐年增高，且有年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著女性的身心健康。桃紅四物湯為中醫(yī)傳統(tǒng)活血化瘀經(jīng)典方劑之一，近來(lái)被廣泛用于腦缺血、心肌缺血、滑膜炎、椎間盤突出等等疾病的臨床研究中，也有報(bào)道可通過(guò)降低腫瘤血管、淋巴管生成發(fā)揮抗腫瘤作用[2-3]。本研究采用免疫組化及流式細(xì)胞方法觀察浸潤(rùn)性乳腺癌病例細(xì)胞增殖核抗原Ki-67、凋亡相關(guān)基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的變化，旨在探討桃紅四物湯抗癌作用的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院2010年1月1日—2011年12月31日收治的經(jīng)病理確診的浸潤(rùn)性乳腺癌患者60例，均為女性，平均年齡51.2歲，其中55例為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，5例為浸潤(rùn)性小葉癌。20例行術(shù)前化療(CAF/CEF或TAC/TEC方案) ，為化療組；20例行術(shù)前化療CAF/CEF或TAC/TEC方案) + 中藥桃紅四物湯，為復(fù)合藥物組；20例未行術(shù)前化療者，為對(duì)照組。

1.2 藥物

桃紅四物湯(藥物組成:桃仁9 g，紅花6 g，熟地黃12 g，當(dāng)歸9 g，白芍9 g，川芎6 g)加水500 mL，煎至200 mL，溫服，每日1劑。復(fù)合藥物組自化療之日起連續(xù)服用桃紅四物湯21 d為1療程，所有藥物由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供。

1.3 主要試劑及儀器

鼠抗人Ki-67抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);Bcl-2-PE、IgG-PE(SantaCruz Biotechnology);Bax-PE、IgG-PE(武漢博世德生物有限公司);BECKMAN COULTER FC500流式細(xì)胞儀;BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化染色儀。

1.4 取材、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果判定

各組病例均取手術(shù)后腫瘤標(biāo)本常規(guī)取材脫水包埋制成石蠟塊。

1.4.1 免疫組化

采用EnVison法，PBS代替一抗作為空白對(duì)照。每一例切片任意選取10個(gè)視野(×400)，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，取其平均數(shù)，記為該例的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以百分率表示。

1.4.2 流式細(xì)胞

采用何琳[4]等介紹的方法并稍作改良。取石蠟包埋組織在切片機(jī)上切取50 μm厚的組織片15～18片，置于試管內(nèi)，加入二甲苯10 mL脫蠟48 h，每天更換1次，然后棄去二甲苯。依序加入100%、95%、70%、50%的梯度酒精5 mL水化,每次水化10 min,最后加入蒸餾水5 mL,5 min后倒出。將組織放入EP管內(nèi)，加入1 mLPBS緩沖液，用眼科剪豎剪將組織剪碎，至顆粒直徑在1～2 mm即可，然后將此混懸液移入流式管內(nèi)，加入1 mL0.25%胰酶消化，37℃水浴20 min，期間每隔5 min震蕩1次，然后加入生理鹽水終止反應(yīng)。用玻璃吸管輕輕吹打液體，將全部混懸液過(guò)100目鋼絲網(wǎng)后得濾液，再經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾至流式管，PBS重懸洗3次，即得單細(xì)胞懸液。取單細(xì)胞懸液0.5 mL加入封閉液PAB2 mL，使用渦旋機(jī)搖勻后，室溫放置15 min,離心1 200 r/min，5 min，去上清液，再加入1∶100稀釋的一抗100 μL,搖勻后，室溫避光，孵育30 min；加入PBS1mL，離心1 200 r/min，5 min，去上清液，加入PBS1 mL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每份樣本均設(shè)陰性對(duì)照(加相應(yīng)IgG抗體)，以消除本底熒光的影響。結(jié)果以陽(yáng)性百分率表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Ki-67蛋白的表達(dá)情況

Ki-67陽(yáng)性部位為細(xì)胞核，對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞多，染色較深，化療組及復(fù)合藥物組陽(yáng)性細(xì)胞較少，染色較弱，各組表達(dá)情況見(jiàn)圖1。計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率，與對(duì)照組比較，化療組及復(fù)合藥物組Ki-67陽(yáng)性百分率均明顯下降，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

圖1 各組Ki-67表達(dá)情況(IHC,×100)

2.2 Bcl-2、Bax蛋白的變化情況

根據(jù)機(jī)測(cè)陽(yáng)性百分率，從對(duì)照組、化療組至復(fù)合藥物組，Bcl-2蛋白數(shù)值逐漸下降，Bax蛋白逐漸升高，Bcl-2/Bax比值逐漸下降，且各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。部分機(jī)測(cè)圖形見(jiàn)圖2。

圖2 各組部分流式細(xì)胞圖

組別例數(shù) Ki-67(%)Bcl-2+(%)Bax+(%)Bcl-2/Bax比值對(duì)照組20 27.4±9.5 43.7±5.138.9±6.21.2±0.3化療組20 20.6±6.8▲ 37.9±5.1▲ 44.9±7.3▲0.9±0.3▲聯(lián)合用藥組 20 20.1±7.3▲ 32.9±2.9▲◆ 56.2±9.6▲◆0.6±0.1▲◆

注：與對(duì)照組比較，▲P<0.05；與化療組比較，◆P<0.05

3 討論

乳腺癌因其發(fā)病率的增高及年輕化趨勢(shì)受到臨床及科研的廣泛重視。而除了西醫(yī)治療手段，在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)中尋找治療方法也成為研究的熱門。乳腺癌在中醫(yī)學(xué)屬于“乳巖”“乳石癰”“乳痞”“乳發(fā)”“乳核”“妒乳”等范疇，在千年以前即有對(duì)此病的描述。明代陳實(shí)功在《外科正宗》里寫(xiě)道“又憂郁傷肝，思慮傷脾，積想在心，所愿不得志者，致經(jīng)絡(luò)痞澀，聚結(jié)成核，初如豆大，漸若棋子；日后腫如堆栗，或如覆碗，紫色氣穢，漸漸潰爛，深者如巖穴，凸者若泛蓮，疼痛連心，出血?jiǎng)t臭，其時(shí)五臟俱衰，四大不救，名曰乳巖?！毙纬稍虬ㄆ咔樗鶄?、飲食失節(jié)、體質(zhì)因素等，朱丹溪認(rèn)為：“乳癌是憂患郁悶，晰夕積累，脾氣消阻，肝氣橫逆所致”。辨證論治是中醫(yī)治療的精髓所在，因此分析、研究、總結(jié)、判斷乳腺癌的中醫(yī)證型具有重要意義，是有效治療的前提。實(shí)際臨床工作中病情復(fù)雜多變，且存在巨大的個(gè)體差異性，不同醫(yī)家提出了多種乳腺癌的辨證分型。吳繼萍等提出中醫(yī)證型分為正虛與表實(shí)兩大類，其中表實(shí)分為血瘀、氣滯、痰濕、熱毒四種[5]。血瘀證是其常見(jiàn)癥型之一，多位學(xué)者研究證實(shí)乳腺癌患者多合并有血瘀證，且血瘀程度與病程相關(guān)。富琦等發(fā)現(xiàn)與早期比較，晚期乳腺癌患者血瘀比例增高，并且血瘀證分級(jí)明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[6]。李淑艷報(bào)道在0期、Ⅰ期、Ⅱ期乳腺癌患者中非血瘀證比例較高，分別占80.0%、68.3%和66.4%，而Ⅲ期患者中血瘀證比例較高，占58.7%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示晚期乳腺癌患者血瘀證比例較高。另外，在腫瘤大于5cm，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目≥4個(gè)的組別中，血瘀證患者比例較高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]。由于原位癌病例僅為0期，浸潤(rùn)癌病例為Ⅰ期或以上，故浸潤(rùn)性乳腺癌病例血瘀證比例明顯高于非浸潤(rùn)性病例。李亞瓊等發(fā)現(xiàn)新輔助化療前后患者血瘀狀態(tài)加重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。

既然確實(shí)有“血瘀”存在，且病情越重，“血瘀”程度也越重，這就表明確實(shí)有應(yīng)用活血化瘀藥物的指征。古今對(duì)乳腺癌的治療均重視補(bǔ)益氣血藥和理氣解郁藥的使用，重視清熱解毒和活血化瘀?；钛?、攻補(bǔ)兼施的治法及中藥復(fù)方治療具有明確的療效[9]。《醫(yī)宗金鑒》中的桃紅四物湯，是活血化瘀組方中的經(jīng)典方劑。其6味組成中藥分別為：桃仁、紅花、白芍、當(dāng)歸、熟地黃、川芎。桃紅四物湯具有養(yǎng)血活血、祛瘀生新的功效。在臨床，桃紅四物湯對(duì)于冠心病心絞痛、胃腸道疾病、腎臟疾病、肝臟疾病、神經(jīng)性疾病及各種婦科和皮膚科疾病均有較好的治療效果[10]。在本研究中，加用桃紅四物湯旨在以行氣、活血藥疏通氣血，達(dá)到以通為補(bǔ)的目的，改善患者的氣滯血瘀體質(zhì)。而至于其作用機(jī)制，在抗腫瘤方面，已有研究報(bào)道桃紅四物湯可減少腫瘤血管及淋巴管生成，降低微血管密度及淋巴管密度，從而起到一定的抗腫瘤療效。另有學(xué)者報(bào)道在小鼠肺癌模型中桃紅四物湯相似的抗腫瘤機(jī)制[11]。連紅琴報(bào)道在實(shí)驗(yàn)性大腸癌中桃紅四物湯可對(duì)凋亡相關(guān)蛋白產(chǎn)生影響[12]，但在乳腺癌病例中桃紅四物湯對(duì)凋亡蛋白及凋亡基因的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。

正常人體細(xì)胞的生長(zhǎng)與死亡受到機(jī)體精準(zhǔn)的調(diào)控，在生理情況下細(xì)胞的死亡稱為凋亡，而細(xì)胞凋亡受到抑制，則本應(yīng)被更新的細(xì)胞可能獲得永生性，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。而另一方面，如果促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生自發(fā)凋亡可能會(huì)發(fā)生導(dǎo)致腫瘤消退的治療作用。因此，對(duì)凋亡基因的研究受到廣泛的重視。Bcl-2基因家族是最早開(kāi)展研究的凋亡相關(guān)基因，其中Bcl-2是t(14:18)染色體異位斷點(diǎn)處發(fā)現(xiàn)的一種癌基因，是一種凋亡抑制基因，其作用機(jī)理包括抗氧化、抑制Bax的細(xì)胞毒、抑制促凋亡蛋白酶釋放等。而B(niǎo)ax是促凋亡基因，自身可形成同源二聚體，破壞線粒體膜，從而形成凋亡啟動(dòng)復(fù)合體，激活半胱天冬酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；此外，它也可以與Bcl-2蛋白形成異源二聚體復(fù)合物，拮抗其自身的促凋亡作用。因此，Bcl-2/Bax比值是決定腫瘤細(xì)胞是增殖還是凋亡的重要環(huán)節(jié)[13-14]。由此可見(jiàn)，如果可以通過(guò)藥物干預(yù)Bcl-2、Bax的任一項(xiàng)或者兩項(xiàng)使得該比值下調(diào)，就可能使得腫瘤細(xì)胞凋亡相比腫瘤細(xì)胞增殖占有優(yōu)勢(shì)，發(fā)揮抗腫瘤作用。在本實(shí)驗(yàn)中，觀察到使用化療藥物組及聯(lián)合用藥組均見(jiàn)Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比值降低，且聯(lián)合用藥組效果更為明顯，說(shuō)明桃紅四物湯聯(lián)合化療藥物更能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抗癌作用更為明顯。

細(xì)胞增殖核抗原Ki-67是一種大分子的DNA結(jié)合蛋白，定位于細(xì)胞核，在有絲分裂中對(duì)維持DNA結(jié)構(gòu)具有重要作用。處于靜止期的細(xì)胞Ki-67染色為陰性，G1后期開(kāi)始出現(xiàn)，S期和G2期逐漸升高，M期達(dá)到高峰。成熟組織細(xì)胞中不表達(dá)，由于其半衰期短，是一個(gè)比較肯定的核增殖標(biāo)志物，目前Ki-67檢測(cè)已經(jīng)被廣泛用于反映腫瘤細(xì)胞增殖速度和預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后[15-16]。其表達(dá)增多表明腫瘤增殖活性高，生長(zhǎng)快，惡性程度強(qiáng)。有學(xué)者報(bào)道Ki-67在乳腺癌組織中表達(dá)量顯著高于癌旁組織，且表達(dá)強(qiáng)度與不良預(yù)后相關(guān)[17]，陽(yáng)性率達(dá)68.2%。本研究觀察到，化療藥物組及聯(lián)合用藥組，Ki-67表達(dá)均明顯減少，但聯(lián)合用藥組與化療組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Ki-67可能不是桃紅四物湯的作用靶點(diǎn)。

我們認(rèn)為，桃紅四物湯對(duì)浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用，但其影響凋亡信號(hào)通路的相關(guān)分子機(jī)制，以及可能的量效關(guān)系等等問(wèn)題仍不明確，還有待進(jìn)一步的研究工作。