張峻淞 ，曾令杰 △，崔丹丹 ，黃嘉玲

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.國家中醫(yī)藥管理局嶺南中藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室，廣東 廣州 510006）

穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees 為爵床科穿心蓮屬的草本植物，全草入藥，主要活性成分有穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯及14-去氧-11，12-二去氫穿心蓮內(nèi)酯（又稱脫水穿心蓮內(nèi)酯）等二萜內(nèi)酯類成分，具有清熱解毒、涼血、消腫、燥濕等功效。穿心蓮飲片為穿心蓮的干燥地上部分，經(jīng)切段、干燥而成，在干燥、貯藏等過程中，穿心蓮內(nèi)酯類成分的含量會發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致其質(zhì)量下降［1-2］。2015年版《中國藥典（一部）》僅規(guī)定了穿心蓮飲片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量［3］，不能全面反映其主要內(nèi)酯成分的變化情況。穿心蓮中除穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯外，還含有較高含量的新穿心蓮內(nèi)酯（達1.615% ）及去氧穿心蓮內(nèi)酯（達 0.76% ）［4-7］。本研究中建立了同時測定穿心蓮飲片中穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯含量的高效液相色譜（HPLC）法，并通過特征圖譜或指紋圖譜來表征上述內(nèi)酯成分及其他成分的相對比例及變化，以準(zhǔn)確反映穿心蓮飲片的質(zhì)量狀況及全面表征，并合理評價穿心蓮飲片質(zhì)量的優(yōu)劣，供其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂時參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Sartoius型分析天平（德國賽多利斯公司，精度為0.1mg）；AK-100D型超聲波清洗器（深圳市潔清洗設(shè)備有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

30 批穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees飲片經(jīng)廣東藥科大學(xué)曾令杰教授鑒定為正品，確認(rèn)為合格穿心蓮飲片樣品。樣品信息詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（18∶82，V／V），梯度洗脫，0～60min時18%A→40%A；流速：1.0 mL ／min；進樣量：20 μL；檢測波長：226 nm；柱溫：室溫。

2.2 溶液制備

分別取穿心蓮內(nèi)酯對照品、脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品、新穿心蓮內(nèi)酯對照品和去氧穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.1 mg的對照品母液，備用。取樣品粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入25 mL 40%甲醇溶液，稱定質(zhì)量；浸泡1 h后，超聲處理40 min（功率為200 W，頻率為40 kHz）；放冷，稱定質(zhì)量，用40%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液10 mL，置中性氧化鋁柱（100～200目，5 g，內(nèi)徑為1.5 cm）上，用15 mL 40%甲醇溶液洗脫；收集洗脫液，置25 mL容量瓶中，加40%甲醇溶液至刻度線，搖勻，即得供試品溶液。

表1 穿心蓮飲片樣品信息

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項下的對照品母液適量，置5 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的對照品溶液。按擬訂色譜條件進樣20 μL測定，以混合對照品溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，分別得穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯的回歸方程，Y穿＝3×107X穿＋61 423（r＝0.999 2），Y新＝6×106X新＋21 605（r＝0.999 3），Y脫＝4×106X脫＋6 862.5（r＝0.999 4），Y去＝1×107X去＋40 743（r＝0.999 2）。

精密度試驗：取2.2項下的對照品溶液，按擬訂色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果4個內(nèi)酯成分總含量的RSD為 0.43%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（S16）樣品粉末 0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，于0，2，4，6，8 h 時測定峰面積。結(jié)果 4 個內(nèi)酯成分總含量的RSD為1.34%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（S16）樣品粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，并測定峰面積。結(jié)果4個內(nèi)酯成分總含量的RSD為1.04%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取穿心蓮飲片樣品（S16）粉末6份，精密稱定，分別加入穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯和去氧穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液各1 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2.4 穿心蓮飲片特征圖譜建立與分析

取不同來源的30批樣品粉末0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣20 μL，建立穿心蓮飲片的HPLC特征圖譜，詳見圖1?？梢?，來源不同的穿心蓮飲片的HPLC圖譜具有共同的鑒別特征，以相似度評價軟件計算，其相似度在95%以上。各樣品的色譜圖中均具有8個明顯的色譜峰，可劃分為3組，詳見圖1 A。第Ⅰ組（t為0～22 min，含溶劑峰），以1號峰為主；第Ⅱ組由4個（或以上）色譜峰（t為22～44 min）組成，穿心蓮內(nèi)酯［2（S）］色譜峰的峰高最大；第Ⅲ組由新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯等色譜峰組成（t為 44～60 min），脫水穿心蓮內(nèi)酯色譜峰的峰高最高。由圖1 B可見，穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯相對于穿心蓮內(nèi)酯的相對保留時間分別為1.0，1.8，2.0，2.1。

2.5 不同來源樣品中4個內(nèi)酯成分含量測定

由圖1 B可見，各批樣品中穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯的峰面積，按各回歸方程計算4個內(nèi)酯的含量，詳見圖2。可見，不同來源的穿心蓮飲片中上述4種內(nèi)酯成分的相對比例及總含量差異較大，有的飲片4個內(nèi)酯的含量均高或均低，有的是某個（或某幾個）內(nèi)酯含量很低，其他內(nèi)酯的含量很高。30批樣品中，穿心蓮內(nèi)酯的含量為0.16% ～0.51%，新穿心蓮內(nèi)酯的含量為0.13% ～0.34%，脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量為0.11% ～0.55%，去氧穿心蓮內(nèi)酯的含量為0.12% ～0.49%，上述4個內(nèi)酯成分總含量為 0.75% ～1.52%。

圖2 不同來源的穿心蓮飲片中穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含量及其總含量的變化

3 討論

穿心蓮藥材或飲片的指紋圖譜或特征圖譜能較全面地鑒別及評價其質(zhì)量［8-16］。為了綜合評價不同來源穿心蓮飲片的質(zhì)量，并監(jiān)控穿心蓮飲片加工和儲存過程中的質(zhì)量變化，本研究中建立了同時測定穿心蓮飲片的特征圖譜及4個主要內(nèi)酯活性成分的HPLC法。結(jié)果表明，來源不同的穿心蓮飲片的HPLC特征圖譜特征基本一致，其差異為各峰的峰值大小和相對比例。穿心蓮飲片的特征圖譜中，共有8個主要色譜峰，且均以脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積最大，其次是穿心蓮內(nèi)酯；穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯相對于穿心蓮內(nèi)酯的相對保留時間分別為1.0，1.8，2.0，2.1。

分別考察了不同比例的水-甲醇、水-乙腈、0.4%H3PO4-甲醇、0.4%H3PO4-乙腈、醋酸鈉緩沖液（pH 6.4）-甲醇、醋酸鈉緩沖液（pH 6.4）-乙腈等的作為流動相的分離效果，最后確定以水-乙腈（82∶18，V／V）梯 度 洗 脫 較 好 。曾 考 察 Agilent，Yilete，Phenomen，Dikma，Diomonsil的 C18色譜柱分別在 15，25，35，45 ℃條件下各色譜峰的分離情況。結(jié)果表明，由不同廠家生產(chǎn)的C18色譜柱對穿心蓮內(nèi)酯的分離有一定影響，其中Agilent，Dikma和Yilete的C18色譜柱均能對穿心蓮內(nèi)酯成分實現(xiàn)較好分離，且柱溫條件對穿心蓮內(nèi)酯類成分分離的影響不明顯，故選擇室溫作為柱溫。

參考2015年版《中國藥典（一部）》中穿心蓮飲片標(biāo)準(zhǔn)的含量測定方法，增加了新穿心蓮內(nèi)酯和去氧穿心蓮內(nèi)酯的含量測定方法。同時測定穿心蓮飲片中穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯這4個內(nèi)酯成分的含量，能更全面地把控穿心蓮飲片的質(zhì)量。