趙俊云,楊曉敏,胡秀華,曹,簡郭血驕,楊向竹,郭健

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029)

失眠為睡眠障礙中最為常見的類型，其主要表現(xiàn)為入睡困難、早醒、睡眠質(zhì)量低下和睡眠時間減少，繼而造成注意力下降、記憶力減退等生理學(xué)改變。長期失眠還將導(dǎo)致精神疾患以及嚴(yán)重慢病的發(fā)生。流行病學(xué)研究顯示，在一般人群中失眠的發(fā)生率約為27%，嚴(yán)重影響人群的生活質(zhì)量，并增加了潛在的社會安全危害，成為重要的社會及醫(yī)學(xué)問題，深入了解失眠的發(fā)生機(jī)制和尋找適當(dāng)有效的治療手段至關(guān)重要。下丘腦-垂體-腎上腺軸(The hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA axis)的過度活躍被認(rèn)為是失眠產(chǎn)生的重要生理學(xué)基礎(chǔ)[1-2]。中醫(yī)基于整體觀對于失眠或稱不寐進(jìn)行了證型分類，臨床上常運(yùn)用方藥、針灸等進(jìn)行辨證施治。本文選取對氯苯丙氨酸(Para-Chlorophenylalanine，PCPA)致失眠大鼠模型為研究對象，心腎不交型方藥交泰丸作為干預(yù)手段，通過觀察血清HPA軸激素促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(Corticotropin-Releasing Factor,CRF)、促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropic Hormone，ACTH)、皮質(zhì)醇(cortisol)的水平評估HPA軸的活躍程度，通過觀察血清表觀遺傳修飾的主要酶DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1[(DNA(cytosine-5-)-Methyltransferase 1，DNMT1]和組蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase，HDAC)活性以及血清乙?；M蛋白H3(Acetyl-Histone H3)水平的變化，探討交泰丸干預(yù)失眠的生理學(xué)機(jī)制和表觀遺傳機(jī)制，為從整體觀闡明方藥的作用機(jī)理提供新的視角。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，SPF級，許可證號:SCXK(京)2015-0015。

1.1.2 藥物與試劑

黃連和肉桂飲片購自北京同仁堂藥店；PCPA購自Ark PharmLnc.(批號:AK-80383，純度>98%);Elisa檢測試劑盒均購自北京奇松生物科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗儀器

3K15高速冷凍離心機(jī)(美國Eppendorf公司)，Safire2酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗分組及動物模型建立

參考文獻(xiàn)[3]的方法，將48只雄性SD大鼠適應(yīng)1周后隨機(jī)分正常組、模型組和交泰丸組。實(shí)驗第1天，模型組和交泰丸組按300 mg/kg一次性腹腔注射 PCPA建立失眠模型，正常組一次性腹腔注射等體積生理鹽水。實(shí)驗第3天，交泰丸組灌胃交泰丸(黃連30 g，肉桂3 g)水提液(5 g/kg)，1次/d，連續(xù)3 d，正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水。

1.2.2 血清檢測

實(shí)驗第6天，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，收集的血液樣品經(jīng)4℃靜置1 h，4℃、3 500 rpm離心15 min，收集血清-20℃保存?zhèn)溆?。血清按ELISA試劑盒說明進(jìn)行各指標(biāo)檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果

2.1 交泰丸顯著降低失眠大鼠血清HPA軸激素水平

與正常組比較，模型組血清CRF、ACTH、Cortisol水平均上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組比較，交泰丸組血清CRF、ACTH、Cortisol水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 血清HPA軸激素水平

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 交泰丸顯著降低失眠大鼠血清DNMT1活性

與正常組比較，模型組血清DNMT1活性顯著上升(P<0.01)；與模型組比較，交泰丸組血清DNMT1活性顯著下降(P<0.01)。與正常組比較，模型組血清HDAC活性下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，交泰丸組血清HDAC活性下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表2。

表2 血清DNMT1和HDAC活性

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

2.3 交泰丸顯著降低失眠大鼠血清Acetyl-Histone H3水平

與正常組比較，模型組血清Acetyl-Histone H3水平上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，交泰丸組血清Acetyl-Histone H3水平顯著下降(P<0.01)。結(jié)果見表3。

表3 血清Acetyl-Histone H3水平

注：與模型組比較，**P<0.01

3 討論

HPA軸是機(jī)體維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)和調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)的重要生理學(xué)基礎(chǔ)。失眠過程中表現(xiàn)的生理上的過度興奮一部分會體現(xiàn)為HPA軸的過度活躍。由下丘腦分泌的CRF是機(jī)體調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，其分泌異常與多種精神疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。CRF可直接作用于腺垂體的促腎上腺皮質(zhì)激素分泌細(xì)胞，可促進(jìn)ACTH的分泌。ACTH可促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)的組織增生以及皮質(zhì)激素(Cortisol)的生成和分泌。當(dāng)皮質(zhì)激素的分泌水平過高時，將反過來影響垂體和下丘腦，減弱其分泌活動，因此，在皮質(zhì)激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制下，HPA軸保持相對的平衡和穩(wěn)態(tài)，對于調(diào)節(jié)睡眠-覺醒的節(jié)律性具有重要意義[1-2]。HPA軸激素在臨床上已作為失眠及其他精神疾患診斷和治療的重要標(biāo)志物。本研究中，模型組的HPA軸較正常組稍顯活躍，基本符合臨床上失眠患者的激素水平的變化趨勢，交泰丸干預(yù)3天后即可見失眠大鼠HPA 軸活躍度顯著下降，說明交泰丸可通過調(diào)節(jié)HPA軸的功能來發(fā)揮治療失眠的效果。同時，交泰丸的HPA軸調(diào)節(jié)作用從一定程度上為PCPA致失眠大鼠的心腎不交證型提供了證據(jù)，也為探討心腎相關(guān)理論提供了實(shí)驗依據(jù)。

表觀遺傳學(xué)已逐漸發(fā)展成為解讀疾病的重要手段之一，相比較傳統(tǒng)的分子生物學(xué)和基因組學(xué)，表觀遺傳學(xué)可從更宏觀的層次對疾病的發(fā)生發(fā)展以及藥物作用機(jī)制進(jìn)行探討，這與中醫(yī)整體觀的核心思想相契合。表觀遺傳學(xué)的范疇相當(dāng)廣泛，本文選取最為經(jīng)典的DNA甲基化和組蛋白乙?；揎椚胧?，嘗試對證候和方藥的表觀遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行探討。

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳修飾途徑，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(主要是DNMT1)的作用下，目的DNA被甲基化修飾，從而改變DNA的構(gòu)象和穩(wěn)定性，進(jìn)而改變DNA與蛋白質(zhì)的相互作用方式，最終引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，從而引起染色質(zhì)片段內(nèi)大量基因功能的改變。因此，其效應(yīng)可能涉及多個方面[4-5]。本文中，模型組血清DNMT1活性較正常組顯著上升，說明模型組動物DNA甲基化水平相對升高，提示由于部分基因的表達(dá)受到了抑制，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞，無法正常應(yīng)答外部刺激。交泰丸干預(yù)可以調(diào)節(jié)DNMT1活性，重新活化受抑制的基因，使機(jī)體恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

組蛋白修飾也是表觀遺傳修飾的重要途徑之一。盡管不同種屬的組蛋白是高度保守的，但組蛋白可在相關(guān)酶的作用下發(fā)生乙?；⒘姿峄?、甲基化等修飾，進(jìn)而對其結(jié)合的DNA片段上的基因功能產(chǎn)生影響。組蛋白乙?；前l(fā)現(xiàn)最早，研究最多的組蛋白修飾過程，目前對組蛋白H3的賴氨酸乙?；芯康淖顬榍宄?。組蛋白的乙酰化水平由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)和HDAC的活性共同決定。當(dāng)HDAC結(jié)合到特定的啟動子區(qū)，該區(qū)域組蛋白去乙?；瘜?dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的抑制[6-8]。本文中，模型組和交泰丸組血清HDAC活性均無顯著變化，但模型組血清Acetyl histone H3水平較正常組有所上升，說明部分基因可能由于組蛋白H3的乙酰化而被激活，同樣導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞，也提示HAT與HDAC之間的平衡被破壞。交泰丸干預(yù)可能通過扭轉(zhuǎn)HAT和HDAC的不平衡狀態(tài)，使Acetyl histone H3水平下降，恢復(fù)部分基因的抑制狀態(tài)。

通過本研究，可以確定的是方藥對于機(jī)體表觀遺傳調(diào)控的可能性，通過DNA去甲基化修飾激活部分基因，同時通過組蛋白乙酰化修飾抑制部分基因，這樣的調(diào)控機(jī)制非常符合中醫(yī)藥的整體觀[9]。此外，本研究中還存在一些問題，如檢測手段單一、檢測指標(biāo)不全、動物只選取了一種性別以及沒有相關(guān)行為學(xué)評價等，將在后續(xù)研究中進(jìn)行完善。基于本文探討的心腎不交證型及方藥，還將繼續(xù)廣泛深入探討心腎相關(guān)理論的表觀遺傳機(jī)制，并可從表觀遺傳學(xué)角度探究證的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制以及方藥的藥理作用機(jī)制，為中醫(yī)藥理論的現(xiàn)代研究開辟新的思路[10]。