許雅寧，李江飛，孫 琦，鄒 東，詹春怡，周亞軍

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130012）

河蚌是軟體動物蚌科一類的總稱，在我國分布廣泛、價格低廉，但該資源并未得到充分利用[1-2]，少部分用作食材，多數(shù)作為廢棄物直接丟棄。河蚌肉具有高蛋白、低脂肪的特點，含有礦物質(zhì)、人體必需氨基酸和微量元素等[3]，對人體具有良好保健功效[4]。通過Caglak A E等人[5]的研究發(fā)現(xiàn)，河蚌肉與傳統(tǒng)肉類相比熱量更低、脂肪含量更低、所含礦物質(zhì)更多，所以是很好的蛋白粉制取原料。

人們對河蚌蛋白粉提取工藝有著很長時間的摸索，張艷萍等人[6]用堿法提取了貽貝中的蛋白質(zhì)并且除去了其中的蛋白多糖，賀琴[7]通過高壓脈沖電場對河蚌蛋白進行了提取，但這些傳統(tǒng)方法，均存在著對原料有所損傷、耗能較高、技術(shù)復(fù)雜等缺陷。近年來，因為有著環(huán)境友好、反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點[8]，酶解法越來越多地被人們應(yīng)用于食品工業(yè)中，但基本上都是利用單一酶進行研究。閆永等人[9]利用木瓜蛋白酶進行河蚌肉酶解軟化工藝的探討。徐兆剛等人[10]選用中性蛋白酶利用響應(yīng)面法進行河蚌酶解工藝的優(yōu)化并制備河蚌蛋白抗氧化肽。宋亮等人[11]采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶等進行河蚌酶解最優(yōu)條件的探索。

但是，酶解的反應(yīng)速率緩慢，大大限制了該項工藝在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。增加酶促反應(yīng)速率的方法有很多種，比如固定化[12]、化學(xué)修飾法[13]，近年來，超聲輻照和微波催化廣泛用于加快反應(yīng)速率，其中已經(jīng)成功應(yīng)用于生產(chǎn)醇類[14]和生物柴油[15]。

試驗以河蚌肉為原料，采用超聲波-微波酶解（木瓜蛋白酶等）提取蛋白，并優(yōu)化酶解工藝，為高營養(yǎng)價值河蚌肉蛋白粉的研制和開發(fā)提供理論依據(jù)和借鑒參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松花江野生被角無齒蚌，購于長春市扶余市長春嶺鎮(zhèn)；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶，南京奧多福尼生物科技有限公司提供；氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀等試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SZ-22型打漿機，廣州旭眾食品器械有限公司產(chǎn)品；JJ200型電子天平，常熟市雙杰測試儀器場產(chǎn)品；PHSJ-4A型試驗pH計，上海禹昂自動化科技有限公司產(chǎn)品；THZ-98A型恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SHJ-4B型恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州高德儀器制造有限公司產(chǎn)品；TGL-16gR型高速臺式冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；MAS-II型微波反應(yīng)儀，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司產(chǎn)品；SP-756P型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；FD-1C-80型冷凍干燥機，北京博醫(yī)實驗儀器有限公司產(chǎn)品等。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料處理

河蚌用清水養(yǎng)2～3 d，去除外殼、蚌淚和內(nèi)臟組織之后洗凈、淋干，用膠體磨絞碎，在-18℃條件下冷凍備用，作為待試樣品。

1.3.2 河蚌肉基本組分分析

測定原料的水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分。詳見1.4.3。

1.3.3 最佳蛋白酶的篩選

參照GB/T 23527—2009中的方法測定所用酶的酶活力。各取5 g樣品，在每種酶的最適溫度、最適pH值下，酶添加量為4 000 U/g，料液比為1∶12，恒溫振蕩（150 r/min） 酶解4 h，結(jié)束后迅速水浴滅酶 （90℃，10 min），離心 （4 000 r/min，10 min） 取上清液，加入雙縮脲試劑，30 min后采用紫外可見分光光度計于波長540 nm處測定吸光度。計算蛋白提取率。從經(jīng)濟和酶解效果等多方面考慮，篩選出最適宜的酶解用酶。

不同蛋白酶的最適反應(yīng)條件見表1。

表1 不同蛋白酶的最適反應(yīng)條件

1.3.4 酶解提取河蚌蛋白

以酶添加量、pH值、酶解溫度、料液比、酶解時間研究其對蛋白提取率影響的變化規(guī)律。取5 g樣品，酶添加量4 000 U/g，料液比1∶12，在酶解溫度55℃，酶解pH值6.5的條件下酶解4 h，結(jié)束后迅速水浴滅酶（90℃，10 min），離心（4 000 r/min，10 min） 取上清液，加入雙縮脲試劑，30 min后采用紫外可見分光光度計于波長540 nm處測定吸光度；計算蛋白提取率，固定其他條件，分別探討不同酶添加量、料液比、酶解溫度、酶解pH值、酶解時間對河蚌蛋白提取率的影響。

酶解提取河蚌蛋白單因素與水平設(shè)計見表2。

表2 酶解提取河蚌蛋白單因素與水平設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果選取適宜條件，以酶添加量、酶解pH值、酶解溫度、酶解時間為因素進行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

1.3.5 超聲波-微波酶解

取10 g樣品，以優(yōu)化得到的條件配制原料液，均質(zhì)2 min，于超聲波-微波復(fù)合反應(yīng)儀下用不同微波功率、微波時間處理，根據(jù)單因素試驗結(jié)果選取適宜條件，增加酶添加量為變量進行L9（34）正交試驗。酶解操作同1.3.4。

超聲波-微波酶解提取河蚌蛋白單因素與水平設(shè)計見表3。

1.4 分析方法

1.4.1 蛋白質(zhì)量濃度及標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

酶解液離心后取上清液1 mL于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，空白調(diào)零，30 min后采用紫外可見分光光度計于波長540 nm處測定吸光度。根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.044 8X+0.006，R2=0.998 3）計算對應(yīng)的蛋白質(zhì)量濃度。

1.4.2 蛋白提取率的計算

式中：C——測得的可溶性蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；

A——稀釋倍數(shù)；

V——蛋白提取液體積，mL；

m——河蚌肉的質(zhì)量，g；

w——河蚌蛋白含量，g/g。

1.4.3 河蚌肉基本營養(yǎng)成分測定

水分，采用直接干燥法測定[17]。；粗蛋白，采用凱氏定氮法測定[18]；粗脂肪，采用索氏抽提法測定[19]；灰分，采用坩鍋法測定總灰分[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 河蚌肉基本組分分析

河蚌肉基本組分分析見表4。

表4 河蚌肉基本組分分析/%

從表4中可以看出，河蚌肉確實是一種高蛋白、低脂肪的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其中粗蛋白含量為7.51%左右，約為河蚌肉干料成分的53.26%，與張緩等人[16]測出的51.07%相近，因此河蚌肉是優(yōu)質(zhì)的蛋白酶解原料。

2.2 最佳蛋白酶的篩選

不同蛋白酶的酶活力值和對河蚌肉蛋白的提取率見表5。

表5 不同蛋白酶的酶活力值和對河蚌肉蛋白的提取率

不同的蛋白酶具有不同的反應(yīng)活力，所以合適的蛋白酶對于河蚌蛋白的提取有著重要影響。由表5可知，其中就酶活力而言，木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶＞中性蛋白酶＞菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶酶活力與其他4種酶相差較大；就酶解效果而言，蛋白提取率中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的蛋白提取效果最好，但是中性蛋白酶的酶解液呈灰褐色，木瓜蛋白酶酶解液呈淺黃色，感官品質(zhì)較好，綜合考慮各種蛋白酶的酶活力值和酶解效果，選擇木瓜蛋白酶進行酶解試驗，與賀琴、郭福軍等人[7，17]的試驗用酶一致。

2.3 酶解提取河蚌蛋白

2.3.1 酶解pH值對蛋白提取率的影響

酶解pH值對蛋白提取率的影響見圖1。

在其他條件相同的條件下，由圖1可知，酶解pH值6.5時，酶解河蚌肉的蛋白提取率達到最大值；酶解pH值大于或小于6.5，蛋白提取率出現(xiàn)下降趨勢。因此，可得出木瓜蛋白酶的最適酶解pH值6.5。

圖1 酶解pH值對蛋白提取率的影響

2.3.2 酶解時間對蛋白提取率的影響

酶解時間對蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 酶解時間對蛋白提取率的影響

由圖2可得知，隨著酶解時間延長，蛋白提取率呈上升趨勢，在酶解時間為4 h處蛋白提取率出現(xiàn)峰值，未到4 h時酶解不充分，超過4 h后可能有蛋白質(zhì)水解。因此，最佳酶解時間為4 h。

2.3.3 酶解溫度對蛋白提取率的影響

酶解溫度對蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對蛋白提取率的影響

除了酶解pH值以外，酶解溫度對于酶的提取效率也有著重要的影響。由圖3可知，酶解溫度小于50℃時，蛋白提取率逐漸增加；在酶解溫度50℃處，蛋白提取率出現(xiàn)峰值；超過50℃后，蛋白提取率出現(xiàn)下降趨勢，推測可能是溫度導(dǎo)致酶失活所致。因此，選取木瓜蛋白酶最適酶解溫度為50℃。

2.3.4 酶添加量對蛋白提取率的影響

酶添加量對蛋白提取率的影響見圖4。

從圖4可知，酶添加量小于3 000 U/g時，蛋白提取率迅速增加；在3 000 U/g處有最大值；超過3 000 U/g后呈下降趨勢。因此，最佳酶添加量為3 000 U/g。

2.3.5 料液比對蛋白提取率的影響

圖4 酶添加量對蛋白提取率的影響

料液比對蛋白提取率的影響見圖5。

圖5 料液比對蛋白提取率的影響

圖6 酶添加量和酶解時間的交互作用圖及等高線

由圖5可知，料液比小于1∶9時，蛋白提取率隨液體比例增加而增大，蛋白水溶水解更充分；在1∶9時，達到峰值；超過1∶9后，蛋白提取率呈下滑趨勢但變化較小。因此，最佳料液比為1∶9。

2.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解提取河蚌肉蛋白

酶解響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平設(shè)計見表6，酶添加量和酶解時間的交互作用圖及等高線見圖6，酶解溫度和酶添加量的交互作用圖及等高線見圖7，酶解溫度和酶解時間的交互作用圖及等高線見圖8，酶解溫度和酶解pH值的交互作用圖及等高線見圖9，酶添加量和酶解pH值的交互作用圖及等高線見圖10，酶解pH值和酶解時間的交互作用圖及等高線見圖11，酶解響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果見表7。

表6 酶解響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平設(shè)計

圖7 酶解溫度和酶添加量的交互作用圖及等高線

圖8 酶解溫度和酶解時間的交互作用圖及等高線

圖9 酶解溫度和酶解pH值的交互作用圖及等高線

利用Design Expert 8.0.6軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到回歸方程為：

蛋白提取率回歸模型的方差分析見表8。

由表8可知，回歸模型顯著（p＜0.01），失擬項不顯著（p=0.063 9＞0.05），R2=0.840 4表明此模型能解釋84.04%響應(yīng)變化，回歸方程擬合度較好，說明此模型能較好地擬合和預(yù)測實際情況。通過比較回歸方程的系數(shù)可以比較因素影響的顯著性[18]。由回歸方程可知，河蚌肉的酶解過程中，對蛋白提取率的影響程度為酶解pH值＞酶解時間＞酶解溫度＞酶添加量。

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化試驗分析得出，木瓜蛋白酶酶解河蚌肉的最優(yōu)條件為酶解時間4.35 h，酶解溫度48.22℃，酶添加量3 729.07 U/g，酶解pH值6.70，與徐兆剛等人[10]的優(yōu)化結(jié)果相近，在此條件下預(yù)測的蛋白提取率為70.297 3%。為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的可靠性，取最佳酶解條件為酶解時間4.4 h，酶解溫度48℃，酶添加量3 729 U/g，酶解pH值6.7，進行3次驗證試驗，測得的蛋白提取率為71.42%，與預(yù)測值接近，表明預(yù)測值擬合性較好。因此，經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)較可靠，具有實用性。

圖10 酶添加量和酶解pH值的交互作用圖及等高線

表7 酶解響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4 超聲波-微波酶解

2.4.1 超聲波-微波處理對河蚌肉蛋白提取率的影響

圖11 酶解p H值和酶解時間的交互作用圖及等高線

表8 蛋白提取率回歸模型的方差分析

超聲波-微波處理對河蚌肉蛋白提取率的影響見圖12。

圖12 超聲波-微波處理對河蚌肉蛋白提取率的影響

超聲波-微波處理可以有效提高蛋白質(zhì)的酶解效率[19]，在其他條件相同時，由圖12可知，超聲波-微波處理與未處理的樣品相比較，在不同的酶解時間，蛋白提取率均有不同程度提高。經(jīng)超聲波-微波處理的樣品在酶解2 h時，蛋白提取率已經(jīng)高于未經(jīng)超聲波-微波處理酶解4 h的樣品，可見超聲波-微波處理不僅能提高蛋白提取率，還大幅縮短了所需酶解時間。

2.4.2 微波功率對河蚌肉蛋白提取率的影響

微波功率對河蚌肉蛋白提取率的影響見圖13。

圖13 微波功率對河蚌肉蛋白提取率的影響

微波可以有效提供能量讓蛋白質(zhì)酶解效率上升，蛋白質(zhì)分解更徹底，但是微波的功率過高可能導(dǎo)致酶或者蛋白的結(jié)構(gòu)遭到破壞，卞蓉霞[20]研究表明，在微波體系中木瓜蛋白酶最為穩(wěn)定，所受微波影響比其他蛋白酶更小。可見找到一個合適的微波功率對于蛋白質(zhì)的提取有著重要的影響。由圖13可知，微波功率為300 W時，河蚌肉酶解的蛋白提取率最高；超過300 W后，隨著微波功率增加，蛋白提取率出現(xiàn)下降趨勢?？赡苁且驗檫^高的微波功率使河蚌肉蛋白或木瓜蛋白酶受熱受到破壞。因此，最佳微波功率為300 W。

2.4.3 超聲波-微波處理時間對河蚌肉蛋白提取率的影響

超聲波-微波處理時間對河蚌肉蛋白提取率的影響見圖14。

圖14 超聲波-微波處理時間對河蚌肉蛋白提取率的影響

由圖14可知，超聲波-微波處理時間為4 min時蛋白提取率最高，超過4 min后隨著微波處理時間加長蛋白提取率下降?？赡苁且驗槌暡?微波處理時間過長使河蚌蛋白和木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)受到破壞。因此，最佳超聲波-微波處理時間為4 min。

2.4.4 正交優(yōu)化超聲波-微波酶解

超聲波-微波酶解正交試驗因素與水平設(shè)計見表9，超聲波-微波酶解正交試驗結(jié)果見表10。

按照極差大小分析出對河蚌蛋白提取率影響的主次順序為C＞A＞B，即處理時間＞酶添加量＞微波功率。正交試驗確定的最佳處理條件為A3B3C2，即酶添加量4 000 U/g，微波功率400 W，微波處理時間3 min。在最佳工藝參數(shù)的條件下進行3次驗證試驗，所得蛋白提取率為87.25%。因此，正交優(yōu)化試驗結(jié)果可靠，具有可行性。經(jīng)超聲波-微波處理后的蛋白提取率比未經(jīng)處理的高出22%，可見超聲波-微波處理不僅加速了酶解，還使酶解程度更加徹底，蛋白利用率更高，這與郝立靜[21]的研究結(jié)論一致。

表9 超聲波-微波酶解正交試驗因素與水平設(shè)計

表10 超聲波-微波酶解正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

（1）通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗得出木瓜蛋白酶酶解河蚌肉最優(yōu)參數(shù)為料液比1∶9，酶解時間4.35 h，酶解溫度48.22℃，酶添加量3 729.07 U/g，酶解pH值6.70。在此條件下，經(jīng)驗證試驗，蛋白提取率達到71.42%，與預(yù)測值基本吻合。

（2）經(jīng)單因素試驗和L9（34）正交優(yōu)化得到超聲波-微波酶解河蚌肉的最優(yōu)參數(shù)為微波功率400 W，微波處理時間3 min。在此條件下，蛋白提取率達到87.25%，是未經(jīng)超聲波-微波處理的蛋白提取率的1.22倍。為進一步制備河蚌肉蛋白粉奠定基礎(chǔ)。